負載花青素的多孔聚乳酸納米纖維指示膜用于無損檢測羊肉的新鮮度

董越,李文博,孫武亮,賈璐,李連業,靳志敏,孫文秀*

1(內蒙古農業大學 食品科學與工程學院,內蒙古 呼和浩特,010018)

2(內蒙古工業大學 材料科學與工程學院,內蒙古 呼和浩特,010051)

3(內蒙古自治區市場監督管理審評查驗中心,內蒙古 呼和浩特,010070)

肉營養價值高、風味獨特,在世界各地被消費和喜歡。但是,肉在貯藏和銷售的過程中,會受到貯存環境和運輸溫度等不良環境的影響,發生腐敗變質。根據聯合國糧食及農業組織的調查,每年食物浪費或損失的數量為13億t,約占世界人類可食用食品總量的三分之一[1]。因此食物浪費是一個急需解決的問題。肉制品在準備、加工和分銷過程中,腐敗已經對肉類工業造成了負面的經濟影響[2]。家庭肉類浪費也是肉類浪費的重要組成部分,肉類浪費成為了一個全球性問題[3]。

智能包裝方法通常用于附加或加入標簽或標記,以監測被包裝食品或食品周圍環境的狀況(如溫度、pH值、水分含量、氣體成分和腐敗代謝物)[4]。肉在腐敗過程中微生物產生的代謝物(如有機酸、胺、氯化氫、含硫化合物、二氧化碳等),會改變肉包裝環境的pH值,而pH值是食品新鮮度和狀態的主要指標[4-6]。因此,pH響應指示膜通過視覺顏色變化提供特定信息,成為一種方便、準確的無損檢測新鮮度的方法[7]。如今,合成染料和天然色素已被用于制作各種pH比色膜[6,8]。合成染料(溴百里酚藍、溴甲酚綠、溴甲酚紫、甲基紅、甲酚紅、氯酚以及二甲苯、間甲酚紫等)對人體健康有潛在的影響,不易用于食品包裝[4,9-10]。因此,具有生態友好性、色域寬廣、功耗較低、對食品和環境的毒性較小的植物基天然色素被認為是最佳選擇[11]。

靜電紡絲作為制備連續納米纖維的一種有效且通用的方法,已被用作制造食品包裝材料的候選者。YILDIZ等[9]以姜黃素、殼聚糖(chitosan, CS)和聚環氧乙烷(polyethylene oxide, PEO)為原料,制備了電紡納米纖維變色pH傳感器膜,用于雞肉新鮮度的監測。首先分貝制備PEO原液、殼聚糖溶液;姜黃素溶液。PEO與殼聚糖溶液混合后,加入姜黃素溶液,制備的混合溶液通過靜電紡絲工藝收集成納米纖維膜。該納米纖維膜應用在4 ℃雞肉的新鮮度檢測上。實驗結果表明姜黃素負載納米纖維膜的顏色變化(明黃色-淡紅色)和雞肉pH值、總揮發性鹽基氮(total volatile basic nitrogen, TVB-N)值隨時間變化密切相關。HAN等[12]以聚乙烯醇-銀納米膠體為載體聚合物,以葡萄籽花青素為指標,開發了一種用于肉類新鮮度評價的智能傳感標簽。首先將銀納米顆粒包埋在聚乙烯醇中制備聚乙烯醇-銀納米膠體中,將納米膠體與葡萄籽花青素混合通過靜電紡絲技術制備成納米纖維膜。新鮮度智能傳感標簽在4 ℃下監測豬肉的新鮮度,隨著貯藏時間的延長豬肉腐敗,傳感標簽顏色也發生了變化(新鮮-淺粉色;次新鮮-棕紅色;腐敗-深灰色)。

花青素是廣泛存在于自然界的酚類化合物,其穩定性容易受到環境因素(pH值、溫度、光線、氧氣等)的影響[13]。SHAVISI等[14]以殼聚糖和阿拉伯膠為基材,提取玫瑰的花青素為指示材料,利用靜電紡絲技術制備納米纖維墊,納米纖維墊在pH值為1～12緩沖溶液中顏色從淡粉色變為棕色。這些一維納米纖維由于其大的比表面積而表現出高的響應性,但具有多孔結構的二維納米纖維更敏感,因為它們充分暴露了響應材料,提供了更多的活性位點[15]。此外,多孔材料也有很多優點,如質量高、易于功能化、化學變化大、節省材料等[16]。近年來,多孔納米纖維已被應用于許多領域,包括催化、傳感器、電極材料、吸附、儲能、過濾和凈化。因此,多孔納米纖維必將在肉類新鮮度檢測中顯示出其優勢和潛力,這將是一種理想的具有高靈敏度的新型無損檢測材料。

靜電紡絲,是一種利用靜電力將聚合物拉伸成連續纖維的纖維成型技術。該工藝導致連續纖維被鋪成具有極大比表面積的非織造布,賦予它們獨特的性能,如增強的表面活性、增加的表面附著官能團的能力、高孔隙率、較好的柔韌性等。聚乳酸是從玉米、小麥和秸稈等可再生資源中提取的乳酸衍生物,是完全可生物降解的材料,可降解成二氧化碳和水。近年來,聚乳酸受到了廣泛的關注,因為它具有相對較高的強度、優異的生物降解性和良好的生物相容性。因此,在本研究中,使用靜電紡絲技術制備了多孔的聚乳酸納米纖維,然后吸附花青素來制備多孔顏色指示膜,用于無損檢測肉類的新鮮程度。然后對其結構、氨響應性、可重復使用性,以分析多孔顏色指示膜在實際應用中的潛力。結果表明,所制備的多孔顏色指示膜能夠準確、快速地對羊肉中釋放的生物胺做出顏色響應。因此,它可以作為一種非接觸式肉眼識別多孔顏色指示膜,用于肉類新鮮度監測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗用羊肉為鮮羊肉,呼和浩特市東瓦窯市場;聚乳酸(poly-L-lactic acid,PLLA,Mw=100 000);藍莓花青素,上海源葉生物科技有限公司;二氯甲烷(dichloromethane, DCM);N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide, DMF);氨水(體積分數為30%);濃鹽酸;碳酸氫鈉(NaHCO3)。

1.2 儀器與設備

TL-F6靜電紡絲機,深圳通力微納科技有限公司;MYP11-2A磁力攪拌器,上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司;CR-20色差儀,日本柯尼卡美能達有限公司;TM 4000 Plus掃描電子顯微鏡,日本株式會社日立高新技術科學;IRSpirit-T 傅里葉變換紅外光譜儀,日本島津公司;FOSS半自動凱氏定氮儀,丹麥福斯集團公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 顏色指示膜的制備

將聚乳酸溶解在DCM中,連續攪拌直至溶液透明均勻,制備聚乳酸溶液。再加入DMF攪拌30 min,最后加入碳酸氫鈉攪拌30 min,制備靜電紡絲溶液。PLLA為12%(質量分數),DCM和DMF體積比為9∶1。

多孔顏色指示膜通過靜電紡絲機制備。將上述制備的靜電紡絲溶液裝入注射器(容積為20 mL)。然后將注射器固定在靜電紡絲機上。用鋁箔收集納米纖維絲。收集器與針尖之間的距離為15 cm。靜電紡絲溶液進給量為1 mL/h、滾筒轉速為150 r/min、電壓為20 kV。濕度分別為20%～30%、50%～60%。將制備好的聚乳酸納米纖維膜完全浸泡在1%花青素溶液(pH=2的緩沖溶液)中24 h。取出后室溫干燥過夜。分別命名為PLLA/花青素/20-30、PLLA/花青素/50-60和PLLA/花青素/NaHCO3/50-60。未經花青素溶液浸泡的膜命名為PLLA/20-30、PLLA/50-60和PLLA/NaHCO3/50-60。

1.3.2 顏色指示膜的表征

1.3.2.1 微觀結構

利用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)觀察了多孔顏色指示膜的微觀結構。對多孔顏色指示膜進行噴金,以便于觀察。纖維直徑分布采用Image Pro-Plus 6.0測量,在掃描電鏡圖像中隨機選擇50個點。

1.3.2.2 傅里葉變換紅外(Fourier transform infrared, FTIR)光譜

花青素粉末、PLLA/20-30、PLLA/50-60和PLLA/NaHCO3/50-60和PLLA/花青素/NaHCO3/50-60通過FTIR光譜進行分析。光譜采集波幅為500～4 000 cm-1。每個樣品的光譜是通過3次掃描的平均值得到,分辨率為4 cm-1。

1.3.2.3 氨響應性

將2 cm×2 cm的PLLA/花青素/NaHCO3/50-60多孔顏色指示膜,置于含有15 mL氨水溶液的密封玻璃培養皿的頂空。玻璃培養皿中氨水的濃度分別為0.001、0.010、0.050、0.100、0.250、0.350、0.500 mg/mL。反應在25 ℃下進行5 min,反應后多孔顏色指示膜的顏色變化值通過色差儀測量。每個樣品重復測量3次,顏色變化的計算如公式(1)所示:

(1)

1.3.2.4 可重復使用性

將2 cm×2 cm的PLLA/花青素/NaHCO3/50-60多孔顏色指示膜置于濃氨水和濃鹽酸環境中,頂空熏制30 s,使用色差儀測量顏色變化。多孔顏色指示膜在濃氨水和濃鹽酸輪流熏制,重復5個循環。根據公式(1)計算ΔE。

1.3.2.5 多孔顏色指示膜在羊肉新鮮度檢測中的應用

PLLA/花青素/NaHCO3/50-60多孔顏色指示膜應用于25 ℃貯藏期間監測羊肉的新鮮度。在無菌環境下,將羊肉在紫外線下照射30 min,去除表面雜菌。接下來,剔除肉中的脂肪和結締組織。稱取(10±0.5) g羊肉放入玻璃培養皿中(直徑=9 cm),將2 cm×2 cm多孔顏色指示膜貼于保鮮膜上,包封在玻璃培養皿頂空,不與羊肉直接接觸。將樣品放在貯藏在(25±1) ℃下,間隔24 h使用色差儀測量多孔顏色指示膜的顏色變化。根據GB 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》測定羊肉的總揮發性鹽基氮值。

2 結果與分析

2.1 掃描電鏡圖分析

圖1為多孔顏色指示膜的微觀結構和直徑分布圖。由圖1-a和圖1-d中可以觀察到,PLLA/花青素/20-30的纖維直徑分布在400～1 700 nm,平均直徑為1 093.27 nm。纖維粗細均勻,纖維表面可以觀察到有大小不均勻的孔。由圖1-b和圖1-e中PLLA/花青素/50-60的纖維形態和直徑分布可知,纖維的直徑分布在600～2 600 nm直徑,平均直徑為1 410.60 nm。纖維粗細不均勻,纖維表明的孔比濕度20%～30%的孔大。觀察到PLLA/花青素/NaHCO3/50-60的纖維形態和直徑分布(圖1-c,圖1-f),纖維的粗細均勻,纖維表面出現更多的孔,且孔大小均勻。這是因為碳酸氫鈉均勻分布在溶液中,在一定的濕度下反應生成二氧化碳和水,從而產生的孔大小均勻。纖維直徑分布在200～1 600 nm,平均直徑為632.48 nm。隨著濕度的增加,纖維表面的孔也增大,加入碳酸氫鈉后產生大小均勻的孔。綜上,PLLA/花青素/NaHCO3/50-60的纖維表面的孔比未加碳酸氫鈉的孔大小更均勻。PLLA/花青素/NaHCO3/50-60的納米纖維直徑較細,具有較大的比表面積。纖維表面均勻的孔更有利于與氣體的接觸,從而提高了新鮮度檢測的靈敏度。

a-PLLA/花青素/20-30的纖維形態;b-PLLA/花青素/50-60的纖維形態;c-PLLA/花青素/NaHCO3/50-60的纖維形態; d-PLLA/花青素/20-30的纖維直徑;e-PLLA/花青素/50-60的纖維直徑;f-PLLA/花青素/NaHCO3/50-60的纖維直徑

2.2 FTIR分析

a-花青素;b-PLLA/20-30;c-PLLA/50-60;d-PLLA/NaHCO3/50-60; e-PLLA/花青素/NaHCO3/50-60

2.3 氨響應性分析

肉品變質過程中產生的生物胺是衡量肉品品質的重要指標。因此,為了測定多孔顏色指示膜對氨氣的檢測能力,使用不同濃度的氨溶液模擬肉品變質過程中環境的變化。如圖3所示,多孔顏色指示膜暴露在1～500 mg/mL氨溶液中時,隨著氨溶液濃度的增加,多孔顏色指示膜的ΔE值也在增加。ΔE>3,顏色變化肉眼可見[20]。多孔顏色指示膜的顏色由紫紅色逐漸變為淺棕色,表明多孔顏色指示膜會隨著氨溶液濃度的增加膜的顏色也會發生變化?；ㄇ嗨刂械狞S酮離子是花青素顯色的重要基團,對pH具有高度的敏感性。其結構會根據不同pH的溶液進行轉變。pH<3,黃酮離子會使花青素溶液變成紅色、紫色;pH 4～5,黃酮離子轉化成為甲醇假堿。呈現無色、淡粉色;pH 6～7,以醌基形式存在;pH 7～8形成陰離子醌基,呈現出藍色;pH>8,形成查爾酮結構,顯示成深褐色[21]。因此,該結果表明多孔顏色指示膜可以對氨溶液進行快速顏色響應。

a-多孔顏色指示膜的ΔE;b-多孔顏色指示膜的顏色變化

2.4 可重復使用性分析

通過在酸性環境和堿性環境下檢測多孔顏色指示膜的可逆顏色變化,如圖4所示。經過5個酸性和堿性環境循環后多孔顏色指示膜可以快速進行顏色響應。在酸性存在下,分子式發生消去反應,形成葉黃素陽離子,使多孔顏色指示膜的顏色由無色變為粉紅色。在堿性環境下,會發生親核加成反應,形成半縮酮,半縮酮中吡喃環會打開形成無色的順式查爾酮結構,顏色指示膜的顏色會從粉紅色變為無色。結果表明,多孔顏色指示膜可用于進行快速、實時、準確的生物胺檢測,顏色變化肉眼可見。多孔顏色指示膜的顏色變化在酸性和堿性環境下具有可逆的顏色變化,因此多孔顏色指示膜可進行重復使用。

圖4 多孔顏色指示膜的可重復使用性

2.5 多孔顏色指示膜在25 ℃貯藏條件下的應用實驗

肉類是一種易腐產品,在貯藏過程中,微生物和內源酶的作用導致其化學成分發生變化。根據肉的腐敗機理,蛋白質和其他含氮化合物的降解會導致有機胺的積累,這些有機胺通常被稱為TVB-N。TVB-N常被用作蛋白質和胺降解的生物標志物[22]。研究者們廣泛采用TVB-N來解釋肉類新鮮度的程度[23-24]。圖5是羊肉在25 ℃下貯藏的總揮發性鹽基氮值。在第0 h,羊肉的TVB-N為7.65 mg/100 g,在第48 h的TVB-N為19.00 mg/100 g,超過規定限值。根據國家標準(GB 2707—2016)中規定的,羊肉的TVB-N不得超過15 mg/100 g。TVB-N值超過15 mg/100 g,羊肉失去食用價值。TVB-N在貯藏期間呈上升趨勢,這是由于腐敗細菌的存在,蛋白質分解,產生胺類物質。貯藏環境中,胺類物質的增加導致pH向堿性方向變化。多孔顏色指示膜的ΔE值隨著貯藏時間延長呈增長趨勢。多孔顏色指示膜的顏色隨著羊肉貯藏時間的延長從0 h的紫紅色到48 h變為暗紫色。72 h多孔顏色指示膜中花青素已經反應到了終點。通過ΔE與TVB-N含量的一致性進行分析,在48 h時羊肉的TVB-N達到限值,不可食用。羊肉貯藏48 h,多孔顏色指示膜的顏色也變為暗紫色。實驗結果表明,多孔顏色指示膜可以進行25 ℃羊肉貯藏期間的新鮮度檢測,會發生從紫紅色(新鮮)到暗紫色(腐敗)的顏色變化。

圖5 25 ℃羊肉貯藏期間多孔顏色指示膜顏色的 ΔE值與TVB-N的關系

3 結論

實驗制備了聚乳酸/花青素/NaHCO3/50-60多孔顏色指示膜,用于羊肉的新鮮度檢測。采用靜電紡絲技術在50%～60%的濕度下利用NaHCO3與水的反應,使多孔顏色指示膜的纖維有更多的孔隙,具有更大的比表面積。通過氨響應性和可重復使用性,驗證了多孔顏色指示膜對氨濃度的敏感性和具有很好的顏色可逆性,證明了其在實際應用的可行性。對羊肉新鮮度監測的實驗結果表明,多孔顏色指示膜在羊肉貯藏過程中顏色變化肉眼可識別,從紫紅色變為深灰色。綜上所述,聚乳酸/花青素/NaHCO3/50-60多孔顏色指示膜在肉品新鮮度監測中具有很大的應用潛力,對我國食品安全檢測技術的研究與開發具有重要意義。