分散固相萃取凈化-超高效液相色譜-串聯質譜法測定蜂蜜中雙甲脒、殺蟲脒及其代謝物

王麗,魏茂瓊,康虹鈺,陳興連,蘭珊珊,張學艷,劉宏程*

1(云南省農業科學院質量標準與檢測技術研究所,云南 昆明,650205)

2(農業部農產品質量監督檢驗測試中心,云南 昆明,650205)

3(云南經濟管理學院 醫學院,云南 昆明,650106)

蜂蜜是一種天然藥食同源物質,富含豐富的糖類、酶類、維生素、氨基酸、礦物質等,素有“玉液瓊漿”、“天然抗生素”之稱,有調節腸胃功能、增強免疫力及抗衰老等功效[1-3]。隨著生活水平提高,消費者對蜂蜜產品需求量和質量品質要求不斷增加。然而,常有關于蜂蜜中藥物殘留超標、摻假等事件報道,使人們對蜂蜜的消費信心和產業發展都受到很大的影響,除營養價值外,藥物殘留問題也一直是衡量蜂蜜品質的一項重要指標[4]。蜂蜜中農藥來源可能是養蜂生產過程不合理噴施殺螨劑等農藥引起的,也可能是蜜蜂采集被農藥污染的花蜜、花粉等遷移至蜂蜜中導致污染[5-6],都將影響消費者的人身安全。因此,對蜂蜜中藥物殘留分析技術的建立及對蜂產品的安全監測,對保障消費者的健康和維護蜂產品產業發展具有重要作用。

雙甲脒(amitraz,AMZ)和殺蟲脒是2種高效有機氮殺螨劑,它們主要應用于蔬菜、茶葉和棉花等作物中害蟲防治,此類農藥也能有效控制蜂蟲病,且對蜜蜂毒性小,在蜂巢除螨中被廣泛應用[7-8]。雙甲脒、殺蟲脒的化學性質不夠穩定,易被水解生成相應代謝產物,研究表明此類農藥母體及代謝產物均對人體肝臟等器官有較大損傷,具有潛在的三致(致癌、致畸、致突變)作用,而且其代謝產物的毒性遠遠大于母體[9]?，F有研究多主要是針對農藥母體或部分代謝物分析,存在農藥種類或代謝物種類分析不全的問題。農藥及其代謝物的同時監測,對食品安全具有更重要的價值。同時測定蜂蜜中雙甲脒、殺蟲脒及其代謝產物的方法少見報道,需要建立快速、有效的同步檢測檢測方法。

目前,報道的蜂蜜或其他基質中雙甲脒、殺蟲脒及其代謝產物測定方法大多為氣相色譜法[10]、液相色譜法[4,11-12]、氣相色譜串聯質譜法[13-14]、液相色譜串聯質譜法[15-16]、膠體金法[17]等,有些方法具有一定的局限性。比如采用氣相色譜法及色譜質譜法分析時需要對母體農藥先進行水解再進行衍生上機分析,過程相對復雜繁瑣,液相色譜法基質干擾對目標色譜峰出峰影響較大,方法靈敏度低,耗時長。液相色譜串聯質譜法因其良好的靈敏度及分離效率,近年來被越來越多地用于各種農藥的檢測分析。且大多數方法前處理方式都采用固相萃取凈化模式,其操作比較費時、溶劑消耗量大、分析成本偏高[11,16]。分散固相萃取(dispersive solid phase extraction,DSPE)技術是基于固相萃取方法開發的一種新型快速樣品前處理技術,將固體凈化吸附劑加入待測樣品萃取液中,直接對目標物質或雜質進行吸附,該技術因具有快速高效優點已被廣泛應用在樣品前處理過程中[14,18]。本研究采用分散固相萃取技術,對色譜、質譜、提取溶劑、凈化方式等儀器條件和前處理條件進行優化,結合超高效液相色譜-串聯質譜技術,建立了針對蜂蜜中雙甲脒、單甲脒(N-2, 4-dimethylphenyl-N-methyl-formamidine,DMPF)、2, 4-二甲基苯基甲酰胺(2, 4-dimethylformamidine,DMF)、2, 4-二甲基苯胺(2, 4-dimethylaniline,DMA)、殺蟲脒、4-氯鄰甲苯胺同時快速檢測方法。結果表明,本方法簡便準確,可以滿足蜂蜜中痕量農藥及代謝物的快速檢測要求,為蜂蜜產品中雙甲脒、殺蟲脒及其代謝物殘留分析提供一些檢測技術方法與基礎實驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

AMZ、DMPF、DMF、DMA、殺蟲脒、4-氯鄰甲苯胺,1 000 μg/mL,天津阿爾塔科技有限公司;甲醇、乙腈(均為色譜純),德國默克公司;甲酸、乙酸銨、氨水(均為色譜純),美國Sigma公司;氯化鈉(分析純),國藥集團化學試劑北京有限公司;N-丙基乙二胺(primary secondary amine,PSA)、氨基鍵合硅膠(amino bonded silicone,NH2)、十八烷基硅烷鍵合硅膠(octadecylsilane,C18)、中性氧化鋁、堿性氧化鋁,天津艾杰爾公司。

實驗樣品:蜂蜜樣品,昆明市超市和農貿市場,4 ℃冰箱內下貯存備用。

1.2 儀器與設備

API 5500 Q TRAP三重四極桿/線性離子阱質譜儀,美國AB SCIEX公司;1290超高效液相色譜儀,美國Agilent公司;BAS224S-CW電子分析天平(感量0.1 mg),北京賽多利斯科學儀器有限公司;TGL-10B-6D高速離心機,上海安亭科學儀器廠;Vortex3型渦旋振蕩器,德國IKA公司;KQ-500DB超聲波清洗儀,昆山市超聲儀器有限公司;GENTRA R200純水機,英國威立雅水處理技術有限公司;0.22 μm有機微孔濾膜,天津津騰儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液配制

混合標準中間液配制:準確吸取上述6種單標標準物質各1 mL用甲醇定容到10 mL,先配制成質量濃度為100.0 μg/mL的標準儲備液,低溫貯存備用。

混合標準系列配制:再準確吸取上述各儲備液于容量瓶中并用甲醇定容,得到6種混合標準中間儲備液,低溫避光保存。系列標準工作溶液分別用甲醇和空白基質配制,現用現配制。

1.3.2 樣品前處理

(1)提取

準確稱取2 g(精確至0.01 g)蜂蜜試樣置于50 mL離心管中,吸取10 mL的純化水加入到蜂蜜樣品中,渦旋振蕩30 s使蜂蜜與水完全混合,放置2 min后加入10 mL的1%(體積分數)氨化乙腈,渦旋振蕩提取1 min,加入6 g氯化鈉固體,渦旋振蕩提取1 min,進行超聲輔助提取30 min,5 000 r/min條件下離心5 min,待凈化。

(2)凈化

稱取凈化材料PSA、C18和NH2各50 mg置于凈化管中,吸取2.0 mL上述未凈化的上清液置于凈化管中,充分渦旋振蕩30 s,以5 000 r/min條件離心5 min,吸取上層溶液過濾膜后供UPLC-MS/MS測定分析。

1.3.3 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)色譜柱,柱溫:40 ℃;進樣量:1 μL。流動相A為0.1%(體積分數)甲酸水溶液,B為甲醇,梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Program of gradient elution

1.3.4 質譜色譜條件

采用電噴霧源離子源(electrospray source ion,ESI),多反應監測模式(multiple response monitoring,MRM),正離子掃描,其中電噴霧電壓為5 500 V,離子源溫度為550 ℃,氣簾氣壓力值為0.226 MPa,輔助加熱氣壓力值為0.379 MPa,霧化氣壓力值為0.369 MPa。6種農藥的質譜條件參數見表2。

表2 六種目標農藥的質譜參數Table 2 Mass spectrometric (MS) parameters for detection of 6 pesticides

2 結果與分析

2.1 色譜和質譜條件的優化

2.1.1 色譜條件的優化

流動相體系對于各農藥的離子化效率、色譜保留出峰時間都由有較大的影響作用。本試驗考察了各目標農藥在流動相為乙腈和甲醇作為有機相時的色譜分離效果,甲醇條件下目標農藥峰形尖銳、基線平穩且分離效果更好,所以本實驗有機相選擇甲醇。

雙甲脒等農藥在ESI源下易形成[M+H]+離子峰,通常情況下在流動相中加入一些甲酸可以提高農藥的離子化效率。本試驗對無機相水溶液內添加不同量的甲酸進行對比試驗,加入甲酸(體積分數)分別為0%、0.02%、0.05%、0.1%、0.2%。結果顯示,DMPF農藥受流動相體系酸度影響較大,不加酸或者酸含量低的情況DMPF出峰響應值很低,其他5種化合物響應值受酸度影響相對較小,同時流動相體系不同酸濃度對各個農藥出峰保留時間影響較大。一般情況為改善待測農藥峰形或提高響應靈敏度,會考慮在流動相中加入乙酸銨等緩沖鹽,本實驗考察流動相體系加入不同濃度的乙酸銨對目標農藥的影響,結果顯示加入緩沖鹽會嚴重抑制DMA農藥的色譜峰響應值。綜合考慮各個農藥的化學性質,本實驗最終選擇甲醇、0.1%(體積分數)的甲酸水溶液為流動相體系。

2.1.2 質譜條件的優化

采用針泵直接進樣方式,在正離子模式下,吸取質量濃度為0.1 μg/mL的6種農藥混合標準溶液,先進行一級母離子掃描,確定各農藥的母離子準離子峰,再分別進行二級子離子掃描,選擇其中響應值和特異性較高的2～3個子離子,在MRM模式下對碰撞能量(collision energy,CE)、去簇電壓(declustering potential,DP)、離子源溫度及毛細管電壓等必要質譜參數進行優化。選擇離子豐度最大且基質干擾小的一個子離子作為定量離子,再選一個子離子作為定性離子。確定最優質譜條件,使各農藥的離子化效率最佳。相關參數如表2所示。

2.2 前處理條件的優化

2.2.1 樣品稀釋體積優化

由于蜂蜜內含糖分較高,水分少且黏度大。所以在對蜂蜜樣品進行分析時,本實驗先加入一定體積去離子水溶液對蜂蜜樣品進行稀釋,起到去除一定的基質干擾作用,再進行有機溶劑提取。實驗對加水體積進行優化,考察1∶1、1∶2、1∶5、1∶10、1∶20 (g∶mL)稀釋條件下各農藥的響應值情況,并與純水中各農藥的響應值做比較。結果顯示稀釋倍數對各農藥都有影響,特別對AMZ和DMPF影響明顯,當稀釋比例為1∶5時,各農藥基本都能達到很好的響應,因此本實驗選擇2.0 g蜂蜜試樣加入10.0 mL水進行稀釋。

2.2.2 樣品提取溶劑和體積優化

目前在對食品、農產品中農藥殘留進行提取時大多選擇甲醇、乙腈等作為提取溶劑。本實驗考慮到甲醇親水的特性,提取液中含有部分水分會使AMZ易發生水解,而乙腈溶劑滲透性較強,通過加標回收法考察,乙腈溶劑提取總體回收率效果好,同時在加入鹽后乙腈易于水相分層更容易后期分析,所以本實驗選用乙腈溶液作為提取試劑。

目前有一些研究已經表明,AMZ類農藥在酸性環境下非常不穩定易發生降解[15],同時AMZ等為胺類化合物,屬于兩性化合物,在堿性條件下會形成游離分子形態更易被有機試劑溶解提取,結合目標農藥酸性條件易降解的特性。本實驗考慮使用在乙腈溶劑中加入不同體積分數的氨水,來保持提取溶劑的酸堿度,提高前處理過程中目標農藥的穩定性,對不同體積分數氨水乙腈溶液(0.2%、0.5%、1%、2%、5%、10%、20%)進行優化,考察每個提取液對目標藥物的總體影響。結果顯示,不同體積分數的氨化乙腈溶液的對AMZ和DMPF兩種農藥影響明顯,當提取溶劑中氨水比例大于10%時,DMPF的回收率明顯下降,而DMF、DMA回收率明顯升高,可能是提取液的PH升高影響了DMPF的穩定性,超過一定pH值時部分降解生成代謝物。當氨水比例在0.5%～5%時,6種目標物質的回收率能滿足大于80%且小于120%,提取效果較理想;但AMZ在提取液濃度為1%時,回收率和峰形相對最好。綜合考慮選用1%(體積分數)氨水乙腈作為本實驗的提取試劑。同時也考察不同提取液體積(10、15、20、25 mL)對目標農藥的提取效果,結果顯示,加入10 mL乙腈時目標農藥基本能得到充分提取,考慮到節約試劑問題,本實驗選擇提取溶劑體積為10 mL。

2.2.3 凈化方法的優化

本實驗首先考察上清提取液不凈化上機分析的效果,結果顯示AMZ的回收率較低,其他5種目標農藥的回收率較高,可能由于蜂蜜提取液內含成分復雜,產生一定基質效應影響。因此,本實驗考察不同凈化材料對樣品提取液凈化效果,以減少蜂蜜中糖、有機酸等內含物對目標農藥分析的影響。主要考察了PSA、C18、NH2、中性氧化鋁、堿性氧化鋁和酸性氧化鋁6種分散固相萃取凈化材料對提取液的凈化效果,并對用量進行優化。結果顯示,使用中性氧化鋁、堿性氧化鋁和酸性氧化鋁凈化時,AMZ、殺蟲脒的代謝物回收率偏高,均大于120%;使用PSA、C18、NH2凈化時,6種目標物質的回收率為85%～107%,對目標化合物的吸附較小,能滿足凈化要求?？紤]到每種凈化材料針對去除的干擾雜質類型不同,PSA主要吸附一些糖、有機酸等極性干擾物質,C18可有效吸附一些脂類非極性物質,NH2適合吸附一些有機酸等極性干擾物質。因此,本實驗選擇PAS、C18和NH2三種混合作為凈化材料。

凈化劑比例和用量會決定處理液的干凈程度和農藥回收率結果。進一步考察C18、PSA、NH2不同用量比例(質量比分別為1∶1∶1、1∶3∶1、2∶2∶1、3∶1∶1)及不同總用量(50、100、150、200 mg)對凈化效果影響。結果如圖1所示,AMZ、DMPF、DMA、殺蟲脒和4-氯鄰甲苯胺5種目標農藥對于所有的凈化材料用量比例提取凈化效果都較好,但代謝物DMF在質量比為1∶3∶1、2∶2∶1、3∶1∶1時凈化時回收率相對偏高,所以確定3種凈化材料C18、PSA、NH2的質量比為1∶1∶1?？疾靸艋牧峡傆昧糠矫?在超過150 mg時6種目標農藥的凈化效果沒有加強且回收率略有下降,可能用量加大對目標農藥有一定吸附,因此確定凈化材料總用量為150 mg。

圖1 不同比例用量C18、PSA和NH2對凈化結果的影響

2.3 基質效應

用液相色譜串聯質譜對基質中的農藥殘留進行色譜分離時,常會有一些共洗脫下來的干擾物質對待測成分的離子化效率產生影響,引起分析物信號的抑制或增強,這種現象就是基質效應(matrix effects,ME)。本實驗比較溶劑標標準曲線和基質標標準曲線的斜率對基質效應的強弱進行評價,結果見表2,僅有DMPF、DMA的|ME|值大于20%且小于50%表現為中等基質效應,其余農藥|ME|均小于20%表現為弱基質效應。本實驗采用基質匹配標準曲線外標法定量克服基質效應影響。

2.4 方法學評價

2.4.1 線性范圍和檢出限

按照本實驗的最優分析條件,配制6種農藥的系列混合基質標準溶液經測定后,以定量離子的峰面積對其各自的濃度進行線性回歸,生成各農藥的標準曲線。6種農藥的方法檢出限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantitation,LOQ)分別以3倍和10倍信噪比計算。結果見表3,本方法6種農藥在0.001～0.2 μg/mL線性范圍內線性關系良好(相關系數r>0.999 1),LOD為0.2～0.8 μg/kg,LOQ為0.7～2.5 μg/kg,該方法6種農藥的相關檢出限相對較低,能夠滿足農藥殘留的測定要求。

表3 六種農藥的線性方程、線性范圍、相關系數、檢出限、定量限及基質效應Table 3 Linear equations,linear ranges,correlation coefficients, LOD, LOQ, and quantitation matrix effects of 6 pesticides

2.4.2 方法回收率和精密度

在空白蜂蜜樣品中按約各農藥定量限值的1倍、5倍、10倍進行3個水平添加回收實驗,每個水平平行6次。結果見表4,AMZ、DMPF、DMF、DMA、殺蟲脒和4-氯鄰苯甲胺的平均回收率為84.1%～113.8%,RSD值為0.9%～6.0%,本實驗建立的方法回收率和重現性良好,適用于蜂蜜中雙甲脒、殺蟲脒及相關代謝物殘留的同時分析測定。

表4 六種農藥的平均回收率和相對標準偏差(n=6)Table 4 Average recoveries and relative standard deviation of 6 pesticides (n=6)

2.5 實際樣品檢測

對采集的12個不同品牌種類的蜂蜜樣品應用本實驗建立的方法進行分析測定,其中2個樣品檢出DMPF和DMF,但檢出含量不高(小于0.02 mg/kg),其他農藥均未檢出。

3 結論

本文建立了蜂蜜產品中雙甲脒、殺蟲脒及代謝物殘留的分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜快速檢測方法。以體積比為1%氨水乙腈作為提取溶液,PSA、C18和NH2混合材料凈化,基質標準曲線外標法定量,該方法前處理操作過程簡單快速,具有較好的準確度和精確度,能夠快速實現蜂蜜產品中雙甲脒、殺蟲脒及代謝物的定性和定量分析,滿足復雜基質痕量農藥分析要求。該方法的應用能提高蜂蜜相關農產品中雙甲脒、殺蟲脒及其代謝物殘留的監測效率,為保障蜂蜜產品的質量安全提供實驗基礎和理論依據。