超高效液相色譜-質譜-一測多評法結合質量控制圖在高溫大曲生產過程品控分析中的應用

楊軍林,田棟偉,王佳,趙雯宇,黃河鷗,范恩帝,朱安然,尤小龍,吳成,胡建鋒,汪地強

(貴州習酒股份有限公司,貴州 遵義,564622)

高溫大曲主要以小麥為原料,通過網羅制曲自然空間環境中的微生物接種發酵,微生物在曲坯中此消彼長,自然積溫轉化并風干而形成的一種多酶多菌的微生態制品[1-2]。高溫大曲是白酒生產過程中的關鍵糖化發酵劑,其品質的好壞直接影響基酒酒質的優劣[3]。在發酵過程中,重要風味成分的前體氨基酸可視為高溫大曲質量評價的重要指標之一[4-5]。因此,實時監測不同生產環節下高溫大曲中氨基酸含量對生產優質高溫大曲尤為重要。

高溫大曲作為白酒香氣及其前體物的重要來源之一,其氨基酸種類及含量是白酒中重要風味成分的前體物之一,主要來源于小麥中蛋白質酶降解、發酵過程中微生物代謝產物及其發酵后微生物細胞自溶等途徑[5-6]。在高溫發酵條件下,氨基酸與還原糖發生美拉德反應,形成一系列縮合、脫羧、脫氨、脫氫等交叉反應,進而生成多種類風味成分,其中,吡嗪類具有特殊的焙烤香、堅果香,酚類具有焦香、似焦糖香,呋喃、吡喃具有醬味,噻唑、噻吩具有焙烤香等,貢獻了白酒中多種香味成分及其前體物[1,4-6]。

一測多評法(quantitative analysis of multi-components by single-marker, QAMS)作為一種多成分質量評價新方法,已在食品領域的多成分檢測中得到成功應用,特別是解決多成分定量分析中對照品短缺和檢測成本高的問題[7-9]。QAMS法通過測定一個成分而實現多個成分的同步測定,大幅度降低成本和實驗人員的工作量,比傳統質量控制方法更加經濟、高效、簡單[10-11]。目前,關于不同基質樣品中氨基酸含量的測定方法較多[12],主要有GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》中氨基酸自動分析法、液相色譜法[13-16]、液相色譜-串聯質譜法[17-21]等,國內外尚未建立結合QAMS法快速測定高溫大曲中多種氨基酸的檢測方法。其次,質量控制圖是一種既便于直觀地判斷分析質量,又能全面、連續地反映分析測試結果波動狀況的圖形,是常規檢測質量控制的一種有效方法,可實現對實驗室分析方法和工作程序進行審視性的連續評價[22-24]。當前,基于Minitab軟件可方便制作質量控制圖,并對數據自動分析,及時發現過程中的異常,實現對生產過程的有效監控[25]。目前,國內外未見關于質量控制圖在高溫大曲生產過程中氨基酸含量分析應用的相關報道。

因此,針對高溫大曲中重要風味成分前體氨基酸的分析多采用氨基酸自動分析儀進行測定,而考慮到氨基酸自動分析儀檢測成本高且耗時長、液相色譜法需柱前衍生處理后上機分析,為更好地評價生產過程中高溫大曲的品質,對其多種氨基酸含量進行全面、準確的分析與控制,通過建立超高效液相色譜-質譜-一測多評(ultra-high-performance liquid chromatography high-resolution mass spectrometry-quantitative analysis of multi-components by single-marker, UPLC-HRMS-QAMS)法開展高溫大曲中多種氨基酸含量的測定,該方法簡便快捷,穩定可靠,僅在消耗參照物情況下便可全面地反映高溫大曲其他重要風味成分前體物氨基酸含量分布。同時,結合質量控制圖可實現在生產過程中高溫大曲的品質監控,這將有助于提升高溫大曲生產過程中品質控制水平,進一步推動釀造白酒的優質優產。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試材

高溫大曲樣品由貴州省某知名醬酒企業提供,選擇該企業制曲車間6間生產曲倉的倉前(上、中、下)、倉中(上、中、下)、倉后(上、中、下)不同位置進行樣品采集,每個曲倉具體取樣位置見圖1。其中,曲倉前上(S11)、曲倉前中(S12)、曲倉前下(S13)采集樣品等比例混勻為曲倉前高溫大曲樣品(S1),依此類推。依據高溫大曲生產工藝可分為“一次翻曲”、“二次翻曲”、“拆曲”3個生產環節,每個生產環節各采集18個樣品,其樣品編號為:S1～S18,共采集3個生產環節54個高溫大曲樣品于-20 ℃條件下貯存備用。

圖1 高溫大曲曲倉內9個取樣位點分布

1.1.2 主要試劑

色譜級甲醇,德國Merck公司;質譜級甲酸,美國Fisher公司;10種氨基酸混合標準溶液(2.5 mmol/LL-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-甲硫氨酸、L-天冬氨酸、L-蘇氨酸、L-賴氨酸),Merck公司;標準品L-亮氨酸(98.1%)、L-異亮氨酸(99.2%),上海源葉生物科技有限公司;標準品L-正亮氨酸(98%)、L-茶氨酸(98%),北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

UPLC-QE Focus高分辨質譜聯用儀,Thermo Fisher Scientific;QT-1旋渦混合器,上海琪特分析儀器有限公司;HC-3518高速離心機,安徽中科中佳科學儀器公司;AR2140萬分之一分析天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;艾科普超純水機,美國Millipore公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 前處理方法

待測高溫大曲樣品經干燥粉碎后過0.5 mm孔徑篩網,精確稱取0.1 g過篩樣品于50 mL離心管內,添加適宜濃度的L-正亮氨酸、L-茶氨酸內標標準溶液,加入30 mL超純水振蕩混勻2 min,超聲15 min,于10 000 r/min下離心5 min,取上清液過0.22 μm濾膜后上機分析。

1.3.2 儀器條件

UPLC條件為:選用Thermo Hypersil Gold(150 mm×2.1 mm,1.9 μm)超高壓液相色譜柱;采用0.1%甲酸水溶液(A)和甲醇(B)為流動相,洗脫程序為0～2 min 100% A,9～13 min 5% A,13.1～16 min 100% A;柱溫為40 ℃,進樣量為2 μL,流速0.2 mL/min,分析時長為16 min。

QE Focus高分辨質譜離子源條件:加熱電噴霧電離源;鞘氣流量:40 arb;輔助氣流量:10 arb;噴霧電壓:3.2 kV;離子源溫度:350 ℃;毛細管溫度:320 ℃。

QE Focus高分辨質譜掃描條件:采用全掃描/數據依賴性二級掃描(Full MS/ddMS2)的正離子掃描采集模式;一級掃描范圍為m/z50.0～400.0 Da;一級掃描分辨率70 000;自動增益控制進入軌道阱中的離子數(AGC target):1e6;最大注入時間(Maximum IT):30 ms;二級掃描分辨率:17 500;AGC target:5e4;Maximum IT:50 ms;歸一化碰撞能量:10、20、30 eV。12種氨基酸化合物信息及高分辨質譜參數見表1,采用內標法定量,儀器采集數據的定性定量分析采用Xcalibur 4.1軟件。

表1 各待測組分化合物信息及高分辨質譜參數Table 1 HRMS parameters of objects and compound information

1.3.3 標準溶液配制

將10種氨基酸混合標準溶液用超純水配制成濃度為100.0 μmol/L的混合標準中間溶液,貯存于4 ℃下備用;精確稱取一定量的L-正亮氨酸(98%)、L-茶氨酸(98%)用超純水溶解后置于10 mL棕色容量瓶中,并定容至刻度,配制成濃度分別為4.57、3.39 mmol/L的混合標準儲備液,避光貯存于4 ℃下備用。

以超純水為試劑,配制成10種氨基酸混合標準系列溶液濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μmol/L(L-正亮氨酸上機濃度為0.457 μmol/L、L-茶氨酸上機濃度為0.339 μmol/L,其中L-正亮氨酸作為L-亮氨酸、L-異亮氨酸和L-纈氨酸的內標物,L-茶氨酸作為L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-甲硫氨酸、L-天冬氨酸、L-蘇氨酸和L-賴氨酸的內標物)。

1.3.4 計算相對校正因子

根據1.3.3節中制備的不同質量濃度的混合對照品溶液進樣上機分析測定得到的各氨基酸對應的峰面積,以L-賴氨酸為參照物,L-賴氨酸對待測氨基酸的相對校正因子fk/m,計算L-天冬氨酸、L-蘇氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-酪氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸的fk/m值。其計算如公式(1)所示:

(1)

式中:Cm、Ck為L-賴氨酸(參照物)和待測氨基酸組分的含量,μmol/L;,Am、Ak為L-賴氨酸和待測氨基酸組分的峰面積。

1.3.5 計算供試品溶液中L-賴氨酸的含量

通過配制0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μmol/LL-賴氨酸標準系列工作溶液,然后按照1.3.2節中所使用的超高效液相色譜串聯高分辨質譜儀以及對應的參數進行上機分析,得到標準溶液L-賴氨酸的含量與峰面積對應的標準曲線,根據供試品溶液中L-賴氨酸的峰面積計算出供試品溶液中L-賴氨酸的含量Cm。

1.3.6 計算供試品溶液中其他氨基酸的含量

根據上述計算得到的相對校正因子fk/m以及供試品溶液中L-賴氨酸的含量Cm,得出供試品溶液中其他待測氨基酸組分的含量。其計算如公式(2)所示:

(2)

式中:Cx為供試品溶液中其他待測氨基酸組分的含量,μmol/L;Cm為供試品溶液中L-賴氨酸的含量,μmol/L;Am、Ax為待測樣品中L-賴氨酸和其他氨基酸的峰面積。

1.4 數據處理

試驗數據采用Excel軟件進行數據簡單匯總分析,運用Origin 8.5軟件進行繪圖,利用Minitab 15.0軟件繪制高溫大曲樣品的質量控制圖。

2 結果與分析

2.1 前處理方法優化

選擇不同體積比的甲醇-水溶液對高溫大曲樣品中提取待測化合物的色譜峰情況進行分析,結果如圖2所示。結果表明,以L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-酪氨酸為例,隨著V(甲醇)∶V(水)比例逐漸降低至 0∶100,即僅以超純水作為提取溶液時,L-纈氨酸、L-甲硫氨酸與L-酪氨酸色譜峰響應值最高,同時,L-甲硫氨酸和L-酪氨酸色譜峰峰寬較窄,且色譜峰峰形明顯較好。因此,該結果表明當V(甲醇)∶V(水)=0∶100時,高溫大曲中重要風味成分前體氨基酸提取效果較佳。

A-L-纈氨酸;B-L-甲硫氨酸;C-L-酪氨酸

2.2 方法學考察

2.2.1 各化合物檢測方法的線性范圍和檢出限及定量限

通過配制濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μmol/L的10種氨基酸混合標準系列溶液(L-正亮氨酸上機濃度為0.457 μmol/L、L-茶氨酸上機濃度為0.339 μmol/L),按上述的儀器條件進樣測定,采用內標法定量。以各氨基酸標準品系列溶液濃度(μmol/L)為X軸,以各氨基酸標準品系列溶液峰面積與相對應內標物質峰面積比值為Y軸進行線性回歸擬合,繪制標準曲線,即得相關線性回歸方程;以信噪比(signal-to-noise ratio,S/N)為3,計算得到各待測組分的檢出限(limit of detection, LOD),S/N為10計算得定量限(limit of quantitation, LOQ),具體內容詳見表2。由表2可知,各待測氨基酸線性范圍為0.05～10.0 μmol/L,且擬合線性方程的線性關系良好(R2≥0.997 0),同時,除L-蘇氨酸(0.1 μmol/L)、L-纈氨酸(0.2 μmol/L),其他8種氨基酸的檢出限均低于0.05 μmol/L,這可實現高溫大曲中微量及痕量氨基酸的精確定性定量分析。

表2 各氨基酸標準工作系列溶液的線性方程、檢出限和定量限Table 2 Linear equation, LOD, and LOQ of each amino acid standard working series solution

2.2.2 各氨基酸測定方法的回收率和精密度

在高溫大曲樣品中根據各氨基酸的定量限,加入3個不同含量的氨基酸標準溶液,使其配制成加標樣品,前處理后利用超高效液相色譜串聯高分辨質譜儀進行分析,每個加標水平做3次平行,每個平行重復測定6次,計算平均回收率,以驗證測定方法的準確度、精密度及穩定性,分析結果見表3。對于3種不同的加標水平,其平均回收率為77.71%～109.56%,且相對標準偏差(relative standard deviation, RSD)為0.24%～4.20%?？梢?該測定方法對高溫大曲中多種重要風味成分前體氨基酸具有良好的回收率、精密度及穩定性,同時,前處理方法對樣品中重要風味成分前體氨基酸損失較低。

表3 各待測組分測定方法的回收率和精密度Table 3 Recovery rate and precision of objects to be measured

2.3 不同生產過程高溫大曲中重要風味前體物含量分析

結合儀器測定和計算可得高溫大曲中L-天冬氨酸、L-蘇氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-酪氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸的fk/m值分別為0.965、0.776、0.559、0.349、0.357、0.295、0.263、0.156、0.250。

通過建立UPLC-HRMS-QAMS法測定不同生產環節下高溫大曲樣品中9種重要風味成分前體氨基酸含量,分析結果見附圖1～附圖3(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.036825)。由附圖1～附圖3可知,在同一生產環節下不同曲倉內不同取樣位置的重要風味前體氨基酸含量均在一定范圍內波動,其中,不同生產環節下高溫大曲中L-甲硫氨酸和L-色氨酸含量均低于其他氨基酸含量,且2種氨基酸含量變化幅度較小;不同生產環節下高溫大曲中L-亮氨酸和L-纈氨酸含量均高于其他氨基酸含量。這些實驗監測數據可用于繪制高溫大曲樣品不同生產環節下質量控制圖,便于后續持續監測高溫大曲生產過程變化情況,以達到有效監控高溫大曲生產過程中品質保障。

為進一步評估UPLC-HRMS-QAMS法測定高溫大曲樣品中重要風味成分前體氨基酸含量的可行性與適用性。分別采用UPLC-HRMS-QAMS法和內標法分析高溫大曲樣品中對應重要風味成分前體氨基酸的含量,對比分析內標法與UPLC-HRMS-QAMS法的標準法差值(standard method difference, SMD)評價UPLC-HRMS-QAMS法測定樣品中重要風味成分前體物氨基酸含量的可行性與適用性。其計算如公式(3)所示:

(3)

式中:CIS與CQAMS分別表示內標法與UPLC-HRMS-QAMS法測定高溫大曲樣品中重要風味成分前體物氨基酸的含量。

通過對“一次翻曲”環節下高溫大曲樣品中的重要風味成分前體氨基酸含量進行測定,通過內標法與UPLC-HRMS-QAMS法分別分析“一次翻曲”下高溫大曲樣品中9種重要風味成分前體氨基酸的含量并計算二者間的SMD,具體如表4所示。其中,各重要風味成分前體氨基酸含量的SMD分別小于0.96%、7.07%、2.77%、7.19%、3.09%、8.49%、1.13%、1.48%、5.28%,實驗結果表明,通過UPLC-HRMS-QAMS法可實現“一次翻曲”高溫大曲樣品中各重要風味成分前體氨基酸含量的測定。

表4 “一次翻曲”高溫大曲樣品中重要風味成分前體氨基酸含量的SMD值 單位:%Table 4 SMD of 9 amino acid of important flavor components precursors in high-temperature Daqu under “first flip” phase

同理,對“二次翻曲”、“拆曲”環節下高溫大曲樣品中的重要風味成分前體氨基酸的含量進行測定。通過內標法與UPLC-HRMS-QAMS法分別分析“二次翻曲”、“拆曲”下高溫大曲樣品中9種重要風味成分前體物氨基酸含量并計算二者間的SMD,分析結果見表5和表6。其中,由表6可知,各重要風味成分前體氨基酸含量的SMD分別小于0.65%、8.13%、2.66%、8.26%、3.68%、2.85%、7.66%、2.92%、8.97%,表明通過UPLC-HRMS-QAMS法可實現“二次翻曲”高溫大曲樣品中各重要風味成分前體氨基酸含量的測定?！安鹎杯h節下高溫大曲樣品的分析結果見表7,各重要風味成分前體氨基酸含量的SMD分別小于7.39%、6.05%、2.31%、9.22%、2.73%、6.30%、2.95%、5.19%、7.92%,表明通過UPLC-HRMS-QAMS法可實現“拆曲”高溫大曲樣品中各重要風味成分前體氨基酸含量的測定。

表5 “二次翻曲”高溫大曲樣品中重要風味成分前體氨基酸含量的SMD 單位:%Table 5 SMD of 9 amino acid of important flavor components precursors in high-temperature Daqu under “second flip” phase

表6 “拆曲”高溫大曲樣品中重要風味成分前體氨基酸含量的SMD 單位:%Table 6 SMD of 9 amino acid of important flavor components precursors in high-temperature Daqu under “tear down” phase

2.4 結合質量控制圖監測高溫大曲生產過程品質變化

將質量控制圖應用于高溫大曲生產過程品質指標評價,使制曲環節的質控水平由傳統管理階段躍升為先進的統計控制階段,這為保證高溫大曲生產過程穩定受控,減少其生產過程質量波動,最終實現高溫大曲質量的持續改進提供技術保障[25-26]。質量控制圖是對質量特性值加以測定、記錄并進行控制的一種圖。根據控制指標,基于Minitab 15.0軟件利用休哈特控制圖中的單值-移動極差控制圖原理用于建立高溫大曲品質監控的質量控制圖,其中,CL表示樣本質量特性值的平均值,控制上限UCL和控制下限LCL依據“3σ準則”按公式(4)～公式(6)計算,移動極差(R)質量控制圖按公式(7)～公式(9)計算,如下所示:

(4)

(5)

(6)

(7)

(8)

LCLR=0

(9)

基于Minitab軟件計算得到高溫大曲品質監控的質量控制圖,如附圖4～附圖6所示(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.036825),質量控制圖是對質量特性值加以測定、記錄并進行控制的一種圖,圖中縱坐標為質量特性值,設有中心CL值、控制上限UCL值、控制下限LCL值;橫坐標為不同生產廠房下不同生產位點下高溫大曲樣本號。

以控制指標的中心CL值、控制上限UCL值、控制下限LCL值確定不同關鍵節點高溫大曲中所述氨基酸含量的合格與不合格區域;若所測定得到的氨基酸含量不在計算得到的質量控制圖的范圍內,則判定為高溫大曲的品質出現了異樣,若所測定得到的氨基酸含量在計算得到的質量控制圖的范圍內,則判定為高溫大曲的品質正常。以此通過測定實驗數據計算得到的質量控制圖來實現高溫大曲生產過程中的品質的監控。

3 結論

相比測定高溫大曲中氨基酸含量的傳統方法,基于UPLC-HRMS-QAMS法可有效解決高溫大曲中多種氨基酸定性定量分析及其質量控制中存在對照品缺乏的問題,在降低檢測成本的同時實現了多氨基酸同步質量控制可反映生產過程中高溫大曲品質。而基于質量控制圖的UPLC-HRMS-QAMS法優勢在于只有既符合質量控制圖的要求又符合含量要求雙重標準的產品才是符合生產要求的高溫大曲,對于控制不同生產環節間高溫大曲的品質一致性具有重要意義。其次,運用質量控制圖大大提高了生產過程中高溫大曲品質評價的效率,具有即時、快速反應的特點,實現了大曲質量的客觀化、系統化評價,可為白酒企業在控制高溫大曲品質方面提供了參考方法。

該研究以收集不同生產環節下高溫大曲為實驗樣品,以L-賴氨酸為參照物通過UPLC-HRMS-QAMS法定性定量分析高溫大曲中9種重要風味成分前體物氨基酸含量,解決了高溫大曲多成分定量和多指標質量控制中存在的對照品缺乏問題。同時,所建立的UPLC-HRMS-QAMS法測定多種氨基酸含量具有快速、簡單、靈敏度高、精密度高,穩定性好等優勢。其次,基于Minitab軟件利用休哈特控制圖中單值-移動極差控制圖構建不同生產環節下高溫大曲品質監控的質量控制圖,應用該方式可實現對不同生產環節下高溫大曲品質的有效監控,進而為制曲生產工藝調整提供數據參考,為實現白酒企業高溫大曲優質優產提供數據支撐及技術保障。此外,基于UPLC-HRMS-QAMS法結合質量控制圖的高溫大曲質量控制模式與現有企業內部標準相比,可反映各重要風味成分前體氨基酸含量的控制水平,也能為進一步完善高溫大曲在生產使用過程中質量控制標準提供依據。

附圖1 “一次翻曲”環節下高溫大曲中9種重要風味成分前體氨基酸含量

附圖2 “二次翻曲”環節下高溫大曲中9種重要風味成分前體氨基酸含量

附圖3 “拆曲”環節下高溫大曲中9種重要風味成分前體氨基酸含量

A-單值控制圖;B-移動極差控制圖

A-單值控制圖;B-移動極差控制圖

A-單值控制圖;B-移動極差控制圖