白酒中甲醛含量的測定及變化規律初探

唐云,宗文文,趙亞雄,郇丹,李永霞,安鵬飛

(金徽酒股份有限公司,甘肅 隴南,742308)

GB 2758—2012《食品安全國家標準 發酵酒及其配制酒》中規定啤酒中甲醛含量為≤2 mg/L,但尚未出臺蒸餾酒中甲醛含量的測定方法和明確限量標準。2006年甲醛被世界衛生組織旗下的國際癌癥機構列為第1類致癌物,即對人體有明確致癌作用的物質,長期暴露可對人體造成損傷[1-2]。目前,白酒中甲醛含量的測定除氣相色譜法、高效液相色譜法及氣相色譜-質譜儀法等外,多參照GB/T 5009.49—2008《發酵酒及其配制酒衛生標準的分析方法》中乙酰丙酮法,相較而言,分光光度法運行成本低,簡單易操作,更受中、小酒企的青睞。但有學者發現白酒若同啤酒等經蒸餾處理后甲醛的損耗較大,使得檢測結果偏低,故多在此方法上進行優化[3-4]。直接法和稀釋法測定白酒中甲醛的含量不經蒸餾,避免了處理過程中的損失,且操作簡單、快捷。其中直接法以純酒樣為對象進行測定,避免了稀釋液對結果的影響,但對于高含量甲醛的酒樣,測定結果不穩定且重現性不佳。而稀釋法不僅可以拓寬檢測的線性范圍,也能彌補直接法的不足。故本文以稀釋法為主,研究測定過程中取樣體積、顯色劑用量、體系pH、稀釋液的種類及顯色條件及其他醛類等對甲醛含量的影響,并追蹤白酒中的甲醛含量,旨在為白酒中甲醛含量的測定和變化規律的研究提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒樣均為濃香型白酒。

甲醛溶液(質量分數為37%)、乙酰丙酮、冰乙酸、無水乙醇、濃硫酸、碘、碘化鉀、氫氧化鈉、硫代硫酸鈉、可溶性淀粉等,國藥集團化學試劑有限公司;乙酸銨,上海麥克林生化科技股份有限公司,所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

TU-1810紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限責任公司;S400-B pH計,梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司;HH-8數顯恒溫水浴鍋,常州無有實驗儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 甲醛標準溶液的配制及標定

甲醛標準溶液的配制及標定均參照GB/T 5009.49—2008《發酵酒及其配制酒衛生標準的分析》,標定后得甲醛標準溶液的濃度為10.008 mg/mL,此為甲醛標準溶液貯備液,用以用水稀釋配制甲醛標準使用液。

1.3.2 標準曲線的繪制

甲醛標準使用液的質量濃度為5.004 mg/L,標準曲線的繪制如表1所示。得標準曲線方程y=0.248 8x+0.037 3,R2=0.999 5,表明甲醛質量濃度為0～2.085 mg/L,線性關系良好。

表1 標準曲線的繪制Table 1 The drawing of standard curves

1.3.3 酒樣中甲醛含量的測定方法

甲醛含量的測定方法參照GB/T 5009.49—2008《發酵酒及其配制酒衛生標準的分析》并略有調整。取一定體積的酒樣于10 mL比色管中,用稀釋液定容至刻度線,加一定量的顯色液,混勻后置于恒溫水浴鍋中顯色,待冷卻后于415 nm處測定吸光值,并對測定結果進行分析。

只改變單一因素,其他條件不變,依次研究取樣體積、顯色劑用量、稀釋液的種類、體系pH、顯色條件及其他醛類物質對測定結果的影響,并通過重現性和加標回收率對方法進行驗證。

1.3.4 成品酒中甲醛含量的變化規律

選取不同酒度、不同產品系列、不同檔次的20個酒樣,貯存于陰涼的環境下,不定期取樣測定酒樣中甲醛的含量,每個酒樣均測定3個時間點,并對測試結果進行分析。

1.4 數據處理

試驗結果以3次測定結果的平均值表示,利用SPSS 22.0進行(P<0.05和P<0.01)顯著性分析,用Origin 2017進行作圖分析。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理過程對甲醛含量的影響

樣品處理過程中可對酒樣中的甲醛濃度產生影響的因素主要有取樣體積、稀釋液的種類、顯色劑用量和反應體系pH。圖1為處理過程中各因素對酒樣中甲醛含量測定的影響結果。

A-取樣體積;B-稀釋液種類;C-顯色劑用量;D-反應體系pH

以純酒樣(取樣體積10 mL)中的甲醛含量為參比,由圖1-A可知,低、中濃度純酒樣中的甲醛含量分別為0.48 mg/L和3.24 mg/L,取樣體積2.5 mL和5.0 mL稀釋后的測定結果與純酒樣的結果相近,無顯著性差異;同條件下,高濃度純酒樣中的甲醛含量為6.11 mg/L,取樣體積為2.5 mL和5.0 mL稀釋后的測定結果分別是7.05 mg/L和7.10 mg/L,二者無顯著性差異,但較純酒樣增加約13.63%,其原因可能是10 mL酒樣中甲醛的含量相對較高,反應不徹底所致,故延長純酒樣的反應時間至40 min,其結果為6.95 mg/L,與稀釋后的結果相近。

稀釋液的種類常用蒸餾水、與酒樣同酒度的乙醇溶液和無水乙醇。由圖1-B可知,以純酒樣中的甲醛含量為對比,當甲醛含量為0.42 mg/L時,取樣體積2.5 mL經水和與其同酒度的乙醇溶液稀釋,稀釋前后的甲醛含量幾乎一致;當甲醛含量為5.52 mg/L時,取樣體積2.5 mL經水和與其同酒度的乙醇溶液稀釋,稀釋后的結果分別為5.76 mg/L和5.77 mg/L,相對標準偏差分別是4.15%和4.48%;當甲醛含量為8.99 mg/L時,取樣體積2.5 mL經水和與其同酒度的乙醇溶液稀釋后的結果分別為9.31 mg/L和8.78 mg/L,相對標準偏差分別是3.51%和2.47%。以無水乙醇作為稀釋液時,3個濃度的酒樣其甲醛含量均有所下降,約降低31.23%～39.33%,猜測可能與反應體系中的乙醇濃度有關。故以水稀釋后酒樣中的甲醛濃度為對照,用不同濃度的乙醇溶液為稀釋液進行驗證,驗證結果如圖2所示。甲醛的濃度隨稀釋液中乙醇含量的增加,其結果均有所下降。其中稀釋液的乙醇濃度在42%vol～52%vol,甲醛的濃度略有變化,但無顯著性差異,乙醇濃度≥58%vol時下降較為顯著,約下降了9.42%～11.74%。此外,同溫度下酒樣經水稀釋比乙醇溶液稀釋,反應的顏色更快更明顯,查閱相關文獻知酒樣中甲醛與乙酰丙酮反應的溫度多高于水中甲醛的測定溫度,這可能是因為白酒中醛類物質可與其他化合物(如醇類)縮合生成結合態醛,從而使得反應滯緩,故需要更高的反應溫度或較長的反應時間。1,1-二乙氧基甲烷是甲醛和乙醇的縮合物,在一定條件下又可轉化成游離醛,剛蒸餾出的原酒中不含1,1-二乙氧基甲烷,而大多年份酒中1,1-二乙氧基甲烷的濃度隨貯存時間有所增加,1,1-二乙氧基甲烷在葡萄酒、朗姆酒等酒中均有檢出[5-9]。

圖2 稀釋液中的乙醇濃度對甲醛濃度的影響

圖1-C為顯色劑的用量對甲醛含量的影響。由圖可知,顯色劑用量在1.0～2.0 mL,甲醛濃度的測定結果與顯色劑用量呈正相關,甲醛濃度越高增幅越明顯;當顯色劑用量在2.0～2.5 mL時,濃度略有所增加,但增幅較為平緩;當顯色劑用量在2.5～3.0 mL范圍內時,3個濃度的酒樣中甲醛濃度結果趨于穩定,測定結果的相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)分別為5.57%、2.36%和0.60%。其中當酒樣中的甲醛含量為0.53 mg/L,顯色劑用量2.0 mL時反應完全;當酒樣中的甲醛含量為3.29 mg/L和6.89 mg/L時,顯色劑用量2.5 mL時顯色完全。此外發現,同濃度的甲醛標準液和酒樣,同等條件下酒樣需要更長的顯色時間才能反應完全,猜測與酒樣中復雜的體系成分有關。白酒經純糧固態多菌種發酵,體系成分達上百種且彼此影響,而標準液是由水逐級稀釋,體系單一。

圖1-D為反應體系pH值對甲醛含量的影響。反應體系pH對酒樣中甲醛含量測定的影響較大,且與酒樣中甲醛含量的大小無關,3個濃度的酒樣測定條件均在pH=6時最佳,這與該反應的原理是吻合的[10]。

2.2 其他醛類物質對甲醛含量的影響

有機物若具有相同的官能團,其化學性質也多相似。白酒中除甲醛外,還有乙醛、乙縮醛、糠醛和苯甲醛等醛類物質,由于酒樣中糠醛和苯甲醛等含量極低,故根據酒樣中乙醛和乙縮醛的含量分布,人為添加3個濃度級別的乙醛和乙縮醛來探究其他醛類物質的存在對甲醛濃度的測定的影響,結果如表2所示。原酒樣中甲醛的含量為(4.844±0.057 5) mg/L,人為添加乙醛和乙縮醛后甲醛含量均略有增加,與汪詠曾等[11]研究結果一致,但由于其他醛類物質造成的結果相對偏差在0.785%～6.245%,影響較小,說明該方法的選擇性佳。

表2 其他醛類物質對甲醛濃度的影響Table 2 Effect of other aldehydes on formaldehyde concentration

2.3 反應條件對甲醛含量的影響

在測定過程中發現,酒樣與乙酰丙酮溶液在室溫下即可發生不同程度的顯色反應,但反應不徹底,需通過加熱使反應更完全。圖3為反應條件對甲醛濃度測定的影響。由圖3-A可知,當酒樣中的甲醛含量為0.45 mg/L時,在60 ℃恒溫水浴反應15 min時即顯色完全;當酒樣中的甲醛含量為6.00 mg/L時,在80 ℃恒溫水浴反應15 min時顯色趨于穩定;而當酒樣中的甲醛含量為9.16 mg/L時,則需更高的溫度才可反應完全。為使反應徹底,后續實驗在96 ℃下進行。

A-顯色溫度;B-顯色時間

圖3-B為顯色時間對甲醛濃度測定的影響。由圖可知,甲醛的濃度與顯色時間呈正比。當酒樣中的甲醛含量為0.45 mg/L時,顯色10 min時已趨于穩定,當酒樣中的甲醛含量在6.00～9.16 mg/L時,需20 min時顯色更為徹底。其次,反應條件也與同批次測定的樣品數量有關,若樣品數量多,則可將樣品分布在多個盛有熱水的玻璃燒杯中(玻璃燒杯的導熱性要優于塑料燒杯),每個燒杯中樣品數量≤10,置于恒溫水浴鍋反應,以免受熱不均致反應進行不徹底,從而使得檢測結果偏低或平行性不佳。

2.4 方法學驗證

基于對稀釋法測定白酒中甲醛含量的影響因素的考察,確定實驗條件為:取樣體積2.5 mL、水為稀釋液、顯色劑用量2.5 mL,96 ℃恒溫水浴中顯色20 min,通過檢出限、定量限、重現性和加標回收率對該方法進行驗證。

2.4.1 方法檢出限和定量限[12]

采用響應的標準偏差和斜率確定方法的檢出限和定量限,檢出限和定量限的計算公式如公式(1)、公式(2)所示。其中σ為空白響應的標準偏差;m為校正曲線的斜率。

(1)

(2)

由表3中空白溶液的響應值,計算得空白溶液的吸光度標準偏差σ=0.000 534 5。根據表1數據進行曲線擬合,得吸光度與濃度的線性關系為:y=0.248 8x+0.037 3,R2=0.999 5。故校正曲線的斜率m為0.248 8,根據公式計算得檢出限值為0.007 088 702 mg/L,定量限值為0.021 480 914 mg/L。

表3 空白溶液的響應值Table 3 Response values of the blank solution

2.4.2 方法重現性

3個濃度級別的酒樣獨立重復8次,計算RSD,結果如表4所示,低、中、高3個濃度級別的RSD分別是3.074%、2.391%和1.492%,RSD值越低則重現性越佳。

表4 重現性實驗結果 單位:mg/LTable 4 Results of reproducibility experiment

2.4.3 方法回收率

由于低濃度酒樣中甲醛的質量濃度較低,為0.44 mg/L,故以基底100%添加標準,中高濃度的酒樣較高,以基底的10%添加標準。由表5可知,低、中、高3個濃度級別的加標回收率分別為114.76%、114.91%和97.89%,表明該方法準確度高,可以適用于白酒中甲醛含量的測定。

表5 樣品的回收率Table 5 The recovery rates of the samples

綜上所述,通過對方法的線性曲線、檢出限、定量限、重現性及回收率的考察,說明該方法可用于白酒中甲醛濃度的測定。

2.5 白酒中甲醛濃度的變化規律

隨機對20個市售濃香型白酒產品中的甲醛的濃度進行追蹤,每個酒樣各追蹤3個時間點,貯存時間初始值以出廠日期計(表6)。

表6 濃香型白酒中甲醛濃度的變化Table 6 The changes of formaldehyde concentration in Nong-flavor Baijiu

由表6可知,各產品中甲醛的濃度隨貯存時間的延長均有所增加(20號產品除外),整體呈貯存前期增幅大,中期增幅較平緩,后期基本趨于穩定,但各個產品的變化增幅不同,猜測與每個產品中的酒體成分的種類和含量等有關;此外每個產品達到甲醛濃度穩定的時間也大不同,少則約1～2個月即可趨于穩定,多則長達2～3年,且在實驗

探究中發現啟封后的酒樣比貯酒罐體中酒樣,甲醛的濃度增幅更為明顯,這可能跟啟封后酒樣與氧氣接觸、放置的環境等條件有關。

“掐頭去尾”是純糧固態法白酒釀造過程中必不可少的環節。由于甲醛的沸點低、易揮發且具有醇溶性,該工藝能可有效控制白酒中甲醛的濃度,故經測定新蒸原酒中幾乎不含甲醛。但原酒到成品酒需經過很多道工序,經歷很長時間。朱夢旭等[13]研究不同年份產原酒中甲醛的變化,發現生產年份較早的原酒中甲醛濃度高于生產年份較晚的原酒(2012年產原酒甲醛質量濃度為0.66 mg/L,1984年原酒高達4.03 mg/L),推測是貯存過程中甲醇被非酶氧化生成甲醛,這與PANOSYAN等[14]發現白蘭地中甲醇濃度與貯存時間成反比吻合。為深入探究白酒中甲醛的變化規律以便更好的控制甲醛含量,后續可同時監測酒樣中的甲醛、甲醇和1,1-二乙氧基甲烷等。

3 結論與討論

分光光度法測定白酒中的甲醛含量,其主要因素在于酒樣中的甲醛含量,可根據甲醛的含量適當改變取樣體積、反應時間和溫度,使得反應更為徹底;需要稀釋時,以蒸餾水或低濃度乙醇溶液為佳。新蒸原酒中幾乎不含甲醛,但成品中不僅含有甲醛,且其含量隨時間的推移逐漸增加,整體呈現“前漲中緩后穩定”的趨勢,穩定時間少則數月,多則2～3年。但目前對酒體中甲醛的生成或轉化途徑、變化規律及控制措施等鮮有報道,后續可圍繞這些方面進行深入的探究。