天然柑橘香豆素的分布、提取分析及生物活性研究進展

王群娣,趙晨露,王旭婷,程玉嬌,2,3,韓冷,2,龍興瑤,余波,劉君,李貴節,2,3*

1(西南大學柑桔研究所,重慶,400712)

2(國家柑桔工程技術研究中心,重慶,400712)

3(農業農村部柑橘類果品質量安全控制重點實驗室,重慶,400712)

4(重慶市第二師范學院兒童營養與健康發展協同創新中心,重慶,400067)

5(四川省丹橙現代果業有限公司,四川 眉山,620299)

6(河南華測檢測技術有限公司,河南 鄭州,450001)

柑橘是蕓香科(Rutaceae)柑橘亞族(Citrinae)的一類植物,包括柑橘屬(Citrus)和枳(Poncirus)、金柑(Fortunella)等5個近緣屬。柑橘果實營養豐富,還具有很高的藥用價值,我國2022年產量已逾6 000萬t,其精深加工與高值化利用潛力巨大。天然香豆素類化合物是一類存在于蕓香科、傘形科、菊科、豆科等高等植物中的次生代謝產物,常以游離態或糖苷化形態出現。一般認為,香豆素的生物合成是植物響應逆境脅迫的重要機制。近年來,研究發現柑橘香豆素在抗抑郁[1]、干預老年癡呆[2]、干擾人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)[3]和新型冠狀病毒[4]以及預防慢性疾病[5-6]等諸多健康領域顯示出積極作用。這些功效及其天然的來源決定了柑橘香豆素在功能性食品和藥物創新等方面具有廣闊的前景。據此,本文綜合了近年來關于柑橘香豆素類化合物的文獻報道,重點歸納和分析論述了柑橘香豆素的結構和分布特點、提取純化和分析技術以及生物活性作用等方面的研究進展,以期為深入研究柑橘香豆素的活性機理、開發其高價值產品、推進其工業化生產和市場應用提供理論和技術依據。

1 柑橘香豆素的結構和分布

香豆素是一類含苯并α-吡喃酮結構的芳香含氧雜環化合物。如圖1所示,根據母核上有無取代以及7-羥基是否和C-6/C-8異戊烯基成環,可將香豆素分為簡單香豆素(傘形花內酯、蛇床子素等)、呋喃香豆素(花椒毒素、異佛手柑內酯等)、吡喃香豆素(魯望桔內酯、邪蒿素等)和其他香豆素(二聚體類香豆素等)。呋喃和吡喃香豆素依據三環的位置關系又可分為線型和角型。迄今為止在柑橘中發現約1 300個香豆素物質,絕大部分為簡單香豆素和線型呋喃/吡喃香豆素。香豆素還可與糖結合形成香豆素苷。

圖1 柑橘香豆素的結構分類及示例

從教師角度而言，對于雙語教學，目前既沒有教學要求，也沒有教學規范，其開展與實施主要取決于學員所輪轉科室或基地的教學習慣[9]。

據有關數據統計，住院期間的母乳喂養率較高，出院后則大幅下降。出生后6個月內的純母乳喂養率僅為20.8%。產褥期會出現多種母乳喂養的問題，導致產婦對母乳喂養信心不足，甚至停止母乳喂養。

表1 常見柑橘香豆素類化合物的結構和分布Table 1 Structure and distribution characteristics of common coumarin compounds in citrus plants

超高效合相色譜(ultra performance convergence chromatography, UPC2)是在二氧化碳超臨界流體色譜基礎上應用UPLC硬件開發的新技術。合相色譜采用CO2為流動相,通過與其他有機溶劑互溶,其洗脫范圍含蓋從強極性到弱極性的寬廣區間,同時兼容正相和反相色譜固定相,還具有超快速、低成本和安全環保的特性,尤其適合高通量組學全譜分析和手性化合物分析。KIM等[42]使用配有CSH-Fluoro-Phenyl(2.1 mm×150 mm, 1.7 μm)色譜柱的Acquity UPC2-PDA系統,檢測朝鮮當歸中的質量標志物紫花前胡醇當歸酯和紫花前胡素(吡喃香豆素類),顯示出更高的分辨率和更短的分析時間,其運行時間僅需4 min。

2 柑橘香豆素的提取、分離和分析

2.1 提取和純化方法

除了體重，你的身高和書本大小也是選購書包的參照標準。你挑選的書包需要有足夠的空間來裝書和文具，在符合條件的書包中，最好選擇小一點兒的。通常情況下，書包的寬度應該小于你的身體寬度。把書包背上身后，書包底端應該在腰以上10厘米處，而不是耷拉在屁股上；書包頂端應該低于你的頭。作為6～9歲的中低年級小學生，你的書包大小在39厘米左右比較適宜。

表2 柑橘香豆素類化合物提取、分離和純化方法比較Table 2 Comparison of extraction, separation and purification methods for citrus coumarins

提取、分離和純化技術是大規模生產制備柑橘香豆素的基礎。傳統方法和新技術都存在各自的優勢和局限性,新技術通常具有更高的效率、更好的選擇性,對環境也更友好,但受限于成本、技術成熟度等因素,尚未形成產業規?；?。為更有效地開發和利用我國豐富的柑橘香豆素資源,需關注以下幾個方面:首先,重點發展與傳統方法適配的輔助提取技術,深入研究超聲、微波等輔助提取的機理和工藝條件,研發安全高效、成熟穩定、廣泛適用的工業化配套裝備。其次,針對不同的品種資源、組織原料和目標物質,研究其最適的提取純化組合方案,例如,水溶性香豆素苷可采用酶解-超聲輔助-熱水逆流提取-超濾-結晶-層析純化的技術組合,而對于熱穩定性強、極性低的香豆素,可采用壓力和微波輔助-超臨界流體萃取分離-重結晶等組合,并進一步在中試和生產放大環節優化技術參數,從而形成基于目標的、可定制調整的成套體系。最后,繼續加強新理論、新技術、新材料等基礎研發工作,推進技術成熟和更新迭代。

分子印跡聚合物具有特定的記憶功能,對模板分子具有強親和力和高選擇性,在生物、環境、食品、醫藥等領域顯示出良好的應用前景。王惠蕓等[38]合成了模板為7-氨基-4-甲基香豆素、支撐介質為聚偏氟乙烯微孔濾膜的分子印跡膜,采用熒光光度法驗證了該印跡膜對模板分子具有良好的識別功能。鐘海藝等[37]以6, 7-二羥基香豆素為模板分子、納米SiO2為表面載體、丙烯酰胺為功能單體,二甲基丙烯酸乙二醇酯為交聯劑,引入溫敏單體N-異丙基丙烯酰胺,合成了具二羥基香豆素特異性吸附能力的溫敏表面分子印跡聚合物。分子印跡研究對天然香豆素的提取檢測提供了新思路和新方法,擁有重大發展潛力。

雙水相提取(aqueous two-phase extraction,ATPE)是一種利用化合物在2種互不相溶的水相間選擇性分配從而同時實現目標物質的提取和初步純化的技術,其典型體系如有機溶劑-鹽系統具有廉價、相對環境友好、傳質-平衡迅速和回收效率高等特點,因而在天然產物提取分離上得以快速推廣。應用于香豆素提取方面,謝玲等[31]將非離子表面活性劑TritonX-114和(NH4)2SO4構成的雙水相體系用于蛇床子素提取分離,其最大萃取率達到98.2%。GHARAT等[32]采用響應面法優化雙水相提取旱蓮草中蟛蜞菊內酯的工藝參數,結果表明,在最優工藝參數下最大得率為0.673%。

炎癥反應與氧化應激密切相關,核因子-κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)則是機體內聯系炎癥反應和氧化應激通路的關鍵蛋白。柑橘香豆素類成分的抗炎癥機制主要體現為抑制炎癥相關信號通路NF-κB的激活、降低機體炎癥介質前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)和白細胞介素-1β(interleukine-1β, IL-1β)等細胞因子的表達,如:佛手柑內酯可通過降低細胞因子IL-6和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)的表達,抑制PGE2、IL-1β、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、一氧化氮(NO)和環氧合酶2(cyclooxygenase-2, COX-2)的活性,緩解脂多糖誘導的細胞炎癥反應[46]。不僅如此,佛手柑內酯還可降低乙酸誘導的結腸炎小鼠炎癥因子升高水平,保護結腸形態,降低肥大細胞脫顆粒率[28]。橙皮油素能通過抑制小膠質細胞活化及降低海馬中COX-2的表達改善脂多糖誘導的小鼠腦缺血性炎癥[47]。除此之外,柑橘香豆素中的異栓翅芹醇和花椒毒酚也有很好的抗炎作用:前者可降低脂多糖誘導的巨噬細胞RAW 264.7中NO、iNOS、COX-2及促炎因子IL-1β的釋放[48];后者能抑制NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3)活化進而抑制NF-κB信號通路激活,緩解骨關節炎癥[49]。

從表2可以看出，存在亞健康狀況的學生中膀胱能量阻滯的現象比較少見，主要存在的問題是能量不足，其中男生11人，女生26人，占亞健康總人數的74%.膀胱能量不均衡的人容易出現背部疼痛、小便異常的現象，情況嚴重者還可能出現記憶力減退的狀況.

柑橘等植物性樣品成分非常復雜,即使經過前處理,所得試樣通常仍是混合物,需將各目標香豆素類物質和雜質之間進行有效分離,才能進一步分析鑒定。為此,一系列分離-分析檢測聯用設備和技術方法應需而生,其主流分析方法為色譜-波譜聯用,將分析色譜強大的分離能力和現代波譜分析技術對分子質量和結構的精確測定充分結合,實現快速、靈敏、準確的定性和定量分析。

超臨界流體萃取和色譜(supercritical fluid extraction/chromatography,SFE/SFC)技術是利用超臨界流體作溶劑從液體或固態樣品中萃取和分離目標組分的方法,最常用的超臨界流體為CO2,具有溶解性強、擴散性能好、條件溫和、無毒無殘留、價廉可循環等優勢。TENG等[30]對超臨界二氧化碳萃取柑橘果皮香豆素如歐前胡素、橙皮內酯和水合橙皮內酯的效率進行了研究,在萃取溫度/壓力為50 ℃/27.6 MPa條件下,3個物質的提取率分別為84%、76%和18%。但此技術所用設備較昂貴,且不適合極性強的如香豆素苷等的分離。

提取方法直接影響柑橘香豆素的得率和生物活性,分離純化將粗提混合物中的目標物質盡量分純,兩者共同組成了樣品前處理工序,為后續研究和開發應用提供基礎和便利條件。與眾多小分子天然產物前處理方法類似,柑橘香豆素提取和純化的常規方法為溶劑提取和色譜純化。溶劑提取法根據物質在不同溶劑中的溶解度不同,選用目標成分易溶且其他成分不易溶的溶劑或其組合,將目標物萃取溶出。常用溶劑有水、甲醇、乙醇和其他中等極性的有機溶劑,常規手段有浸漬、煎煮、滲漉、回流等。溶劑提取操作簡單、成本低,但存在耗時長、提取率低、雜質含量高以及溶劑殘留等問題。色譜純化法最常使用分配柱層析,利用提取物中各組分在固定相和流動相中分配系數不同,經多次反復分配將組分分開,從而收集得到目標物質。該方法需反復操作且分離能力有限,常需結合分子篩、離子交換等其他手段?；诮浀涔?液分配色譜原理,上世紀80年代又發展出一種連續高效的液-液分配色譜——高速逆流色譜,適合復雜天然產物的分離制備,特別適用于結構和性質高度相似化合物的有效分離。近年來新型溶劑和協同輔助提取以及特異性純化等新技術得以廣泛應用,進一步提升天然香豆素的獲取效率?，F將柑橘香豆素各類前處理方法及其特點比較呈現,如表2所示,并就其中代表性進展做簡要介紹。

超聲能通過高頻振動產生的多級效應幫助組織和細胞內容物在溶劑中溶解;微波則通過誘導分子旋轉和振動產生熱能加速物質擴散和溶解。壓力輔助溶劑萃取法,也稱加速溶劑萃取,是在較高的溫度和壓力下用有機溶劑萃取固體或半固體的方法。與傳統溶劑提取法相比,超聲、微波和壓力輔助萃取法具有耗時耗能少和提取率高等優點。高幼衡等[33]采用超聲輔助提取廣佛手5, 7-二甲氧基香豆素,分別以甲醇、95%乙醇、乙酸乙酯為提取溶劑,對提取時間和溶劑用量進行了考察;結果表明,乙酸乙酯超聲提取3次,每次15 min,可完全提取5, 7-二甲氧基香豆素,且雜質干擾少。GENOVESE等[34]以乙醇為萃取溶劑分別結合微波和超聲輔助萃取7-異戊烯基香豆素和橙皮油素,結果顯示微波提取得率為0.143 mg/g和0.535 mg/g,超聲提取得率為0.168 mg/g和0.649 mg/g。CHU等[35]采用加速溶劑萃取法從佛手中提取香豆素類物質,甲醇為萃取溶劑,在90 ℃、壓力10.342 1 MPa下,5 min內得到東莨菪內酯、異莨菪亭、7-羥基香豆素、6, 7-二甲氧基香豆素、5, 7-二甲氧基香豆素、佛手柑素等6種香豆素類物質,回收率為95.1%～104.9%。各類輔助提取均存在機理還未完全明確的問題,即目標物質受超聲場、微波場以及壓力作用的分子行為還有待解析;由于場能不均造成的局部高溫、高能等因素也可能會對目標提取物產生影響。除上述輔助提取方法外,酶輔助法提取柑橘果膠和類黃酮的技術已經成熟,但未見用于香豆素的提取報道。農業農村部西南大學柑桔加工綜合利用集成科研基地已建成完整的酶解-超聲輔助-逆流提取中試科研生產線,未來將在多技術聯合提取柑橘香豆素方面積極開展研究攻關和應用推廣。

2.2 香豆素的分析方法

2.1.3 特異性分子印跡法

體外和體內研究表明柑橘香豆素具有顯著的抗氧化活性。柚子冷榨精油具有較好的體外抗氧化能力和清除自由基的長效活性[44],其中橙皮內酯、氧化前胡素、環氧橙皮油素、環氧佛手柑素等具有環氧取代基的香豆素被認為與該作用密切相關。KIM等[45]發現橙皮油素對排卵后老化的卵母細胞具有積極的保護作用,能激活控制Nrf2途徑的抗氧化活性,通過減少自由基,提高谷胱甘肽(glutathione, GSH)的水平,增強抗氧化酶的活性,起到抗氧化的作用。

近年來,一些新技術逐步開發成熟并實現商品化應用,使得前端分離性能進一步提升。LC-LC聯用,亦稱二維液相色譜(2D-LC)或多維液相色譜(multidimensional liquid chromatography, MDLC),采用先進接口切換技術將不同分離性能的色譜柱鏈接起來,特別適合從復雜混合體系中分離找出一維模式難以發現的共流出組分。MDLC常用2種分離模式:a)中心切割模式,即將前級色譜中某部分傳遞到后級色譜中繼續分離;b)全二維(LC×LC)模式,即通過接口將前級色譜中的全部組分連續傳遞到后級色譜中分離。DUGO等[41]采用正相MDLC中心切割模式分離柑橘精油中的香豆素對映異構體,其中一維柱為微粒硅膠填料,二維柱為纖維素基手性填料,流動相為正己烷和異丙醇,在線檢測器為PDA。結果顯示,該方法能夠分離取代基上含有手性碳原子的柑橘香豆素對映異構體并實現在線分析,相比傳統制備-離線分析的方法,具有大幅縮短時間和節省溶劑用量的優勢。

此外,部分半揮發性香豆素類物質可通過氣相色譜(gas chromatography, GC)聯用技術予以分析,如與質譜、核磁共振、傅里葉變換紅外光譜等聯用。理論上只要香豆素沸點低于GC毛細管柱的最高耐受溫度即可;實際操作中,考慮高溫下的柱流失、香豆素降解和異構化等因素,柱箱最高溫度設置常低于300 ℃,因此該方法只適用于小部分沸點較低的香豆素。GYAWALI等[43]采用GC-MS分析了柚子果皮和果肉的超臨界CO2提取物,共鑒定出69種成分,其中7-甲氧基-8-(2-氧代-3-甲基丁基)香豆素峰面積占果皮總物質的11.4%。

柑橘是我國傳統醫學常用藥。橘皮(陳皮)最早以“橘柚”之名載于《神農本草經》:“味辛溫。主胸中瘕熱逆氣,利水谷。久服去臭,下氣通神?！薄兜崮媳静荨肥纵d“佛手柑”(佛手)一藥:“佛手柑氣味辛、甘、平、無毒……可化痰、清火、延年?！贝送?常見柑橘屬藥材還有枳殼、枳實、橘紅、橘絡、青皮等,具有順氣、止咳、健胃、化痰、消腫、止痛、疏肝理氣等多種功效。香豆素是本屬植物的重要成分,也是其生物活性的主要物質基礎?，F代研究發現,柑橘香豆素具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗菌及多方面保護作用,其中大量研究圍繞橙皮油素、橙皮內酯衍生物以及佛手柑素等成分展開,其活性作用機制簡要歸納如圖2所示,并在下文予以概述。

3 柑橘香豆素的生物活性

當前,大型先進儀器資源越來越豐富,質譜等設備已趨常規化,但費用昂貴、操作復雜、耗時長、對樣品前處理要求高、人員配置要求高等限制因素仍然存在。柑橘香豆素類化合物種類繁多、結構復雜,存在多種性質相近的同分異構體,且含量大多為微量甚至痕量水平,商品化標準對照物質也還比較缺乏,這些因素都給分析檢測帶來了很大的挑戰。此外,儀器生成的巨量數據,也需要更高效、便捷的處理工具,以確?？焖贉蚀_地獲取分析結果。未來研究中,在開發更先進的分析技術和硬件裝備的同時,也需同步研發更智能的數據處理軟件,以提升數據挖掘分析和信息處理判斷能力。

圖2 柑橘香豆素的生物活性及作用機制

3.1 抗氧化及抗炎癥作用

2.1.2 超聲波、微波及壓力輔助萃取法

3.2 抗癌活性

柑橘香豆素在預防結直腸癌、腎細胞癌、肺癌、肝癌等多項研究中均表現出顯著的抗癌活性,其作用機制包括誘導癌細胞凋亡、阻滯細胞分裂周期、抑制癌細胞增殖和遷移等。佛手柑素能顯著性抑制體外培養的人肝癌細胞HepG2、早幼粒白血病細胞HL-60和人胃癌細胞BGC-823的增殖活性[5],還能通過阻滯細胞周期G2/M及抑制細胞的遷移和侵襲作用降低肺癌細胞A549線粒體的膜電位,起到促進癌細胞凋亡的作用[29]。橙皮油素可通過抑制小鼠結腸癌細胞CT26的增殖和遷移促進癌細胞的凋亡[50],通過抑制聚(ADP-核糖)聚合酶10(poly ADP-ribose polymerase10, PARP10)的表達抑制人結腸癌細胞HCT116的活性[51],還可激活小鼠體內的Nrf2-ARE氧化通路,增加小鼠肝臟胞質谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione S-transferase, GST)的活性,從而降低小鼠肝癌的發生率[52]。其他柑橘香豆素,如5-香葉氧基-7-甲氧基香豆素,可以將細胞阻滯在G0/G1期,激活腫瘤抑制因子p53、胱天蛋白酶3(caspase-3, CASP3)、CASP8、B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)家族的相關基因,同時抑制p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)磷酸化,進而抑制人結腸癌細胞SW-480的活性[20]。

本研究觀察了丹溪痛風膠囊對CIA模型大鼠關節及滑膜的病理改善及血清TNF-α和IL-6水平的影響,實驗結果顯示:丹溪痛風膠囊能明顯改善關節滑膜的病理損傷程度;同時能夠明顯降低血清中TNF-α和IL-6的水平。表明丹溪痛風膠囊能通過下調血清中TNF-α和IL-6的水平,延緩或阻斷機體的炎癥級聯反應,從而對類風濕性關節炎起到治療的作用。

3.3 對心血腦管的作用

柑橘香豆素對心血管系統具有降低血壓水平、抑制膽固醇攝入、改善脂質和葡萄糖代謝異常和炎癥反應等有益作用。研究發現,橙皮油素不僅能激活過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor-α, PPAR-α),緩解苯腎上腺素誘導的心肌肥大導致的心力衰竭,還可通過控制小鼠細胞中三?；视秃陀坞x脂肪酸的積累、減小脂肪細胞的體積及抑制空腹血糖的升高來改善由高糖脂飲食引起的代謝紊亂,起到緩解心血管疾病的作用[53]。對小鼠巨噬細胞系RAW 264.7研究表明,酸橙花中提取的佛手酚可阻斷由脂多糖誘導的MAPK信號通路傳導并抑制NF-κB激活,降低氧化低密度脂蛋白誘導的類固醇受體RNA激活因子(steroid receptor RNA activator, SRA)和白細胞分化抗原36(cluster of differentiation 36, CD36)依賴的膽固醇攝取,即同時干預炎癥異常激活和脂質積累等關鍵誘發因素,減緩對動脈粥樣硬化起關鍵作用的泡沫細胞的形成[6]。

3.4 對神經和精神類疾病的干預作用

持續的氧化應激和慢性炎癥是抑郁癥和其他精神類疾病的潛在作用機制,而柑橘香豆素有良好的體內外抗炎和抗氧化作用,因而具有緩解此類疾病的潛力。這其中對橙皮油素的研究最為深入。AMINI-KHOEI等[1]發現橙皮油素通過降低小鼠海馬體和血清NO水平、血清丙二醛(malondialdehyde, MDA)水平以及提高抗氧化能力發揮抗抑郁作用。對雙側頸總動脈結扎導致的腦缺血癡呆大鼠使用橙皮油素干預,發現其腦組織病理損傷有所減輕,皮層和海馬組織中MDA水平降低,GSH表達增加,學習和記憶能力得到改善[2]。FURUKAWA等[54]發現,橙皮油素可通過抑制小鼠小膠質細胞過度激活、海馬星形膠質細胞中COX-2表達及腦黑質中多巴胺神經元細胞的死亡等途徑發揮神經保護作用,并進一步研究了富含橙皮油素的河內晩柑(Citruskawachiensis)果汁對人認知能力的影響。結果表明,富含橙皮油素的柑橘汁能夠減緩老年人認知能力的下降,其作用達到顯著水平。2018年日本消費者廳批準將富含橙皮油素的河內晩柑汁列入“功能性聲明食品”名錄。然而,除此之外尚未見其他關于橙皮油素臨床研究及其商品應用的報道。

3.5 對消化系統的保護作用

3.6 其他活性作用

4 結語與展望

柑橘鮮果和加工產品消費面廣,具有豐富的營養和保健價值。作為中藥材,在臨床方劑及現代中成藥中應用廣泛。其食藥同源功效和現代藥理作用廣泛且顯著,逐漸受到國內外研究者關注。近年來,國內外學者對柑橘天然產物及其活性作用研究愈發深入,隨著高效、高分辨率和靈敏度的分析檢測技術和方法的發展,大量柑橘香豆素類化合物被發現和鑒定,為其化學物質基礎、功能活性及作用機制的研究提供了豐富的資源和堅實的基礎。

本文綜述了近年來研究柑橘香豆素類化合物的結構和分布特點、提取分析技術方法及其生物活性等方面的文獻報道和進展。文中系統整理了30余種常見柑橘香豆素的結構和取代特征,歸納簡述了它們在不同柑橘品種和組織中的分布特點,總結了橙皮油素、橙皮內酯、佛手柑素及其衍生物等代表成分的活性作用和機制。

隨著信息網絡社會的到來，傳統建筑設計已經難以滿足人們的需求，進而產生了現代智能建筑并日益成為時代發展的潮流。智能建筑集成了現代建筑、網絡和計算機等先進技術，達到建筑建設經濟、智能、舒適與高效的目的。在智能化工程項目建設過程中，需要涉及多方面的技術和復雜的施工建造。為滿足整個智能工程的建造需求，確保智能工程的便捷性，整個工程建造應具有較高的整合度。

香豆素的構成和含量在不同柑橘品種、砧穗組合、組織部位、環境條件及發育階段均有差異,其多樣性乃至精細時空分布規律還有待研究,其復雜的合成路徑和調控機制尚未充分解析。柑橘香豆素化學成分復雜、結構類型多樣、含量差異巨大,這就導致了提取和分離難度的增加;為實現柑橘精深加工、開發香豆素功能產品,建立更為高效的分離純化技術工藝顯得尤為重要。柑橘香豆素及其衍生物在計算模擬分析、體外細胞、實驗動物體內乃至臨床研究中展現出廣泛的生物活性和作用潛力,這方面的工作方興未艾,還有待深入研究:a)全面活性評價:當前的研究和開發主要集中在常見簡單香豆素和線型呋喃香豆素,還有大量的資源沒有被評價和利用,更多的功能活性如免疫調節等還未展開研究。利用計算機及人工智能輔助的高通量活性虛擬篩選技術可極大提升初期的工作效率。b)活性機制研究:柑橘香豆素生物活性涉及多種途徑和靶點,口服攝入還可能影響腸道微生態和代謝組,與生物體產生更復雜的聯系。對其的系統性研究還處于起步階段,需利用現代分子生物學技術和多組學手段,全面揭示柑橘香豆素的活性機制和信號通路。同時,需深入研究其結構-活性關系,針對關鍵靶點篩選出高活性的目標成分,指導高價值產品的研發。c)相互作用和安全性:不同香豆素間能否產生協同、拮抗等相互作用,與其他活性物質或藥物是否相互影響,以及潛在的安全風險和毒副作用尚未得到充分的評估。雖然佛手柑素等部分呋喃香豆素已被證實可抑制細胞色素P450酶系、影響治療心血管疾病的藥物代謝、或造成嚴重的安全隱患,但更多的柑橘香豆素還有待全面開展毒性、安全性和相互作用評價。d)公共衛生與臨床研究:目前鮮有相關的人群健康研究和臨床試驗報告,且這些試驗的樣本量較小、研究期限較短,仍處于初級階段。因此,在已確立有效性和安全性的基礎上,需逐步開展更多的包括臨床干預在內的人群縱貫性研究,以驗證柑橘香豆素的人體功效。