裂解多糖單加氧酶的研究進展

陳凌宇,李志建,刁文濤,王佰濤,劉德海

1(河南工業大學 糧油食品學院,河南 鄭州,450001)

2(河南省科學院生物研究所有限責任公司,河南 鄭州,450008)

3(河南省微生物工程重點實驗室,河南 鄭州,450008)

多糖類天然產物是自然界中一類重要的生物資源,在生命發展的過程中也發揮了關鍵作用。木質纖維素作為多糖類天然產物的重要組成部分,主要由纖維素、半纖維素、木質素組成,其在自然界大量存在,也是植物細胞壁的主要組成部分。在全球能源以及資源緊張的情況下,木質纖維素作為可再生資源越來越受到人們的重視,開發利用木質纖維素在降低資源浪費的同時還能減少環境污染。

目前,針對木質纖維素存在2種降解方式,一種是化學水解,另一種是利用酶制劑進行高效酶解[1]。相對于化學方法,酶催化水解具有反應條件溫和、能耗低、環境友好等優勢,成為近年來的研究熱點。通過微生物代謝的糖苷水解酶(glycoside hydrolases,GH)對木質纖維進行降解,是一種高效的生物質資源化方法[2]。但是,植物細胞壁內的纖維素大多為高強度、高密度結晶態,構成了一道天然的“防降解壁壘”,阻止了糖苷水解酶對多糖鏈結晶區的可及性,限制了其高效降解[3]。同時, GH活性低,不耐高溫,不耐酸堿,或有抑制劑干擾,限制了其大規模應用。因此如何高效降解結晶區成為人們的研究動力。近年來,裂解多糖單加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenase,LPMO)的發現完全顛覆了對酶解法降解結晶多糖的認知[4]。LPMO是一類銅離子依賴性氧化酶,它可以通過氧化作用切斷多糖類中的糖苷鍵,從而使難于降解的生物質發生解聚并暴露出更多與GH結合的位點,從而加快纖維素和幾丁質的水解[5]。

1 裂解多糖單加氧酶的發現

最初人們從粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)中發現一種分子質量很小的碳水化合物結合模塊33家族(carbohydrate-binding module family 33,CBM33)蛋白,該蛋白與甲殼素有強烈的結合作用,命名為甲殼素結合蛋白(chitin binding protein,CBP21)[6]。隨后的研究表明CBP21可以在有氧和電子供體條件下,氧化裂解幾丁質多糖,并且發現酶活性可能與二價銅離子有很強的相關性,因其內切葡聚糖酶活性被歸入GH61家族[7]。并且研究發現在太瑞斯梭殼孢霉(Thielaviaterrestris)發酵液中加入等量的瑞氏木霉(Trichodermareesei)纖維素酶,可有效地增加纖維素的降解,顯著增加了糖分的轉化率。在此基礎上,太瑞斯梭殼孢霉菌和瑞氏木霉細胞外纖維素酶系差異分析結果顯示,篩選到3種與糖類代謝有關的胞外酶,即GH61B、GH61E、GH61G。這類化合物雖不是GH61家族成員,卻能明顯增強預處理后的玉米秸稈中纖維素酶的活性[8]。2011 年,這種具有銅離子依賴性并且能夠氧化斷裂纖維素中的糖苷鍵的酶被命名為 LPMO,其能夠實現對生物質的解聚,將底物的作用位點完全暴露,從而實現對纖維素的高效降解。

2 裂解多糖單加氧酶的分類與來源

最初根據氨基酸序列的相似性,將 LPMO分為CBM33和GH61家族兩大類[9]。由于LPMO的氧化作用可以促進糖苷鍵的斷裂,增加了底物和GH結合位點的親和力,加快了其降解效率。2013年,LPMO被歸于碳水化合物活性酶(carbonhydrate-activity enzymes database,CAZy)數據庫中的輔助活性(auxiliary activity family,AA)家族。如今,由CAZy數據庫中的信息和對LMPO中氨基酸序列與功能之間的分析將LPMO分為8個家族,分別為AA9-11、AA13-17輔助活性家族。它們的來源及底物如表1所示,其中GH61和CBM33分別屬于AA9和AA10家族。

表1 LPMO的分類、來源和底物Table 1 The classification, sources, and substrates of LPMO

LPMO主要分布在細菌和真菌中[12]。AA9家族來源于真菌,主要降解纖維素、半纖維素、木質素。AA10家族是LPMO中最大的家族,最早發現馬氏沙雷氏菌中,其大多來自于細菌也有少量來自于真菌、古生菌,降解底物為纖維素和幾丁質。

真菌來源的AA11、AA13、AA14家族LPMO對多糖底物均有降解。細菌來源的AA11家族對幾丁質有降解作用,AA13家族的LPMO能在C1位點切斷淀粉骨架鍵釋放寡糖從而起到對淀粉的降解作用,AA14家族則可降解木質素。最初, LPMO僅存在于微生物中,在小魚中AA15LPMO的新發現引發了人們對動物 LPMO的關注[13]。AA15家族LPMO主要來源于真菌、動物、植物等真核生物對蝦殼中的幾丁質也有降解作用[14]。AA16家族LPMO來源于真菌和部分卵菌中,對纖維素有活性的同時也能協同纖維素酶共同降解纖維素[15]。AA17家族LPMO是目前唯一存在于真菌中具有果膠酶活性的LPMO家族[16]。

3 裂解多糖單加氧酶的結構和功能

3.1 裂解多糖單加氧酶的結構

迄今,已知的LPMO均為β-三明治折疊和組氨酸支架構成的高度保守平面結構[17-19]。以來源于嗜熱子囊菌(Thermoascusaurantiacus)的LPMO(TaLPMO)結構為例(圖1),β-三明治折疊,由 8～10個反向平行的β-折疊通過α-螺旋相互連接組成;LPMO的活性中心(圖1)包括2個保守的組氨酸(His),以及一個酪氨酸(Tyr)或苯丙氨酸(Phe),其分支可以將銅離子固定在其上[20]。除了AA14家族,其他LPMO的結構中均含有銅離子的活性中心。此外,其他的組氨酸骨架在軸位上為酪氨酸(Tyr),而在AA10上為苯丙氨酸(Phe),是其重要的底物結合位點[21]。

圖1 TaLPMO三維結構和活性位點[17]

目前所知的 LPMO一般是一種具有除催化域之外的多個區域的酶,除此之外,還具有CBM。在源于粉紅面包霉菌(Neurosporacrassa)體內的LPMO(NaLPMO)中就有天然形式的CBM[22],同時LPMO的催化結構域可以與CBM組合從而影響活性。這種模式下不僅可以讓酶與底物結合得更好,也使底物的多樣性得到極大地加強。

3.2 裂解多糖單加氧酶的催化機制

LPMO在氧分子和電子供體同時存在時,通過氧化的方式斷裂多聚糖主鏈的 β-1,4 糖苷鍵產生寡糖,電子供體大多為酶類還原劑。后來的研究表明該過程要有銅離子的參與,催化過程中LPMO在氧和銅原子存在條件下生成LPMO-Cu2+復合物,電子供體產生的電子將其轉化為LPMO-Cu+復合物。該復合物得到氧分子中的電子產生銅離子過氧化物中間體,有多余電子情況下氧化多糖內C1或C4位的碳原子生成羥基化多糖并產生水[23-25]。還有一種觀點認為LPMO在電子和H2O2存在下產生LPMO-Cu2+羥基復合物,從而達到氧化多糖的作用。LPMO作用機制(圖2)不同于糖苷水解酶,兩者協同作用可以提高對木質纖維素的轉化效率,首先LPMO在電子供體和銅離子條件下,切斷纖維素結晶區之間的糖苷鍵,使其出現更多GH的作用位點而增加對纖維素的降解速度。

圖2 LPMO的催化機制[29]

LPMO根據氧化位點的不同可以分為三類(圖3)。第一類只對多糖的C1位進行氧化,產生醛糖酸,第二類僅對多糖的C4位進行氧化,產生C4酮醛糖,最后一類作用C1和C4產生醛糖酸和C4酮醛糖[26-27]。LPMO共底物是O2還是H2O2一直是一個在討論的話題,現在較多的實驗表明H2O2作為共底物的酶活性較高[28]。

圖3 LPMO反應途徑

3.3 裂解多糖單加氧酶的功能

杜文珍等[30]對絲狀真菌(Podosporaanserina)中AA11家族的5個LPMO 基因進行定點敲除的實驗中,5個基因同時被敲除后,菌株對碳源的吸收能力明顯降低、生長速度下降、孢子萌發速率降低,子實體數量減少、部分子實體發育不良、壽命縮短以及纖維素降解能力降低。由此表明菌株中的AA11家族基因影響著其生長、生殖、衰老和纖維素降解方面。來源于蟬棒束孢菌(Isariacicadae)突變體基因IcFBR1其包含糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白(glycosylphosphatidylinositol-anchored protein, GPI-AP)同系物的LPMO。敲除IcFBR1后,孢梗維管束不再出現,菌落氣生菌絲發育和產孢均不正常。菌體中的多糖含量明顯減少,同時還伴隨著淀粉酶、蛋白酶活力的降低。其在調控蟬花梗束發育、次生物質代謝以及營養物質的吸收等方面發揮著重要的調控功能[31]。

此外,LPMO在動物植體內也發揮著重要作用。如黑腹果蠅不同的發展階段中LPMO中有著高水平的表達,同時基因發生改變之后對其致死率有著影響[32]。MoAa91(AA9家族的LPMO)是水稻瘟疫病菌中一個具有誘導黏附作用的蛋白,其敲除會導致黏附能力下降,從而阻礙了水稻的侵染[33]。昆蟲以植物為主要食料,其消化道內的酶類及其與共生菌共同完成對植物的高效消化。家蠶無腸道菌群,因此,來自家蠶中腸區的 LPMO(AA15)在其中扮演了重要角色[12]。

4 裂解多糖單加氧酶活性測定方法

LPMO的活性測定影響因素較多。一方面氧化產物多為不溶解性底物,另一方面由于直接作用于底物效率較低。由于LPMO與O2和電子供體(如抗壞血酸)存在的條件下形成H2O2,基于此通過分析H2O2來表示酶活性的測定方法有2,6-二甲基苯酚比色法和Amplex Red辣根過氧化物酶法。通常也可用協同活性來表示表示LPMO的活性,二硝基水楊酸法(3,5-dinitro-2-hydroxybenzoic acid, DNS)便是一種比較普遍的方法。

4.1 二硝基水楊酸法(DNS法)

二硝基水楊酸法是以二硝基水楊酸和還原糖在堿性環境中的氧化-還原反應為基礎,以540 nm波長下的吸光值為指標,對還原糖的含量進行了測定。將 LPMO和GH對纖維素底物進行協同作用,將其與 DNS試劑進行混合之后,再進行加熱顯色,并記錄還原糖的 OD540吸光值,通過將單獨測活和協同測活以產物的提高量進行比較,來判斷 LPMO的活性[34]。此法簡單、價格低廉,但其靈敏度不高,僅能對還原性糖類進行測定,而對某些非還原性糖類物質則不能進行測定。此法用于研究LPMO與其他酶的協同作用,但是只能對樣品中的單糖進行定量分析。

4.2 2,6-二甲基苯酚比色法(2,6-dimethoxyphenol,2,6-DMP法)

研究表明[35]2分子2,6-DMP和1分子H2O2在LPMO酶的作用下產生2分子2,6-DMP自由基在不穩定的條件下自發二聚產生1分子氫化木醋醌然后與1分子H2O2在LPMO下產生黃色顯色產物木醋醌,由木醋醌在469 nm波段具有特征吸收峰即可表現出LPMO活性(圖4)。這種方法快速、簡單能對濃度0.5～50 mg/L的LPMO進行活性測量,已用于測定纖維素和甲殼素中LPMO的活性,但是該方法在酸性條件下靈敏度較差。氫化木醋醌是比2,6-DMP更好的底物,表觀 KM 值低約 30 倍,氧化電位低 160 mV。底物被氫化木醋醌代替之后酶活性顯著提高且在酸性pH 值為4～8時也能夠檢測到,得到了更穩定的檢測條件和更高的靈敏度[36]。毛相朝等[37]用該方法檢測經過純化后EbLPMO10A的酶活性,達到了356.36 U/g,同時測得該酶的最適溫度與pH值分別為60 ℃和7。

圖4 2,6-DMP法測LPMO酶活性原理

4.3 Amplex Red辣根過氧化物酶法

Amplex Red是一種很好的過氧化物酶底物,在檢測H2O2中具有很高的靈敏度和穩定性。在過氧化物酶催化下,Amplex Red試劑與H2O2按1∶1的定量比例發生反應,生成具有紅色熒光的氧化產物試鹵靈對其進行熒光強度的測定,間接表示LPMO活性。這一方法是以測定H2O2的產量來表征 LPMOs的活力。方法靈敏度很高且操作方便快捷在測定LPMO活性方面有著廣泛的應用[38]。用 Amplex Red辣根試劑盒測定 LPMO活性,結果表明[39],H2O2的濃度在0.25～5 μmol/L和5 μmol/L辣根過氧化物酶的條件下,構建H2O2標準曲線且相關性很好(R2=0.99)。后續研究發現[35]測定LPMO為20～574 mg/L時有著比較準確的結果,實驗過程中若存在游離態銅離子會對于結果造成影響[40]。

5 裂解多糖單加氧酶的克隆與表達

LPMO資源豐富,但其生產效率低、分離困難。為進一步提高 LPMO的產量,促進其產業化,通過在其他寄主中進行異源表達,是一條行之有效的途徑。由于AA9基因來源于真菌,畢赤酵母是應用最為廣泛的一種真核表達體系,由于其基因操縱技術的成熟,已經被廣泛應用于異源表達AA9[41]。除畢赤酵母外,已有部分AA9基因在其他真菌的表達載體上進行了改造,但仍面臨著轉化困難、操作難度大等問題。

為進一步提高AA9的產量,通過在真菌表達宿主中構建了一系列的信號肽來實現AA9的高效表達,表達載體為畢赤酵母最常見的信號肽是α-因子信號肽和AA9 的原生信號肽。LADEVZE等[42]在畢赤酵母中使用2種信號肽表達3種蛋白,結果表明由原始信號肽分泌的LPMO含有更多正確的N端His以及3種采用原生信號肽的酶的比活均大于α-因子信號肽。來自紅側耳Pleurotusdjamor的PdLPMO,通過添加組氨酸標簽、基因密碼子優化、增加基因劑量以及聯合共表達分子伴侶蛋白等方法,使構建菌株蛋白含量與酶活性提高75%和66.92%[43]。AA10大部分來源于細菌,目前主要是在芽孢桿菌和大腸桿菌中進行異源表達。有些AA10利用它們自身的信號肽表達,有些則利用其他蛋白的信號肽,AA10對不同信號肽的作用效果存在差異。在對比不同AA10 的信號肽中,SmAA10A的信號肽相比其他蛋白的信號肽有著更強的優勢,還能實現多種蛋白的高效表達[44]。徐倩倩[45]在構建 CsLPMO的異源表達過程中,得出pET-22b為最優的表達質粒,后續對其菌株表達條件優化后可溶性蛋白含量與酶活性分別提高 32.1%和45.2%。

LPMO家族的異源表達,主要表達宿主為大腸桿菌和畢赤酵母。從真菌中分離得到的AA9在畢赤酵母中比大腸桿菌更容易得到高產。與此相反,AA10主要來自于細菌,在大腸桿菌中表達較好。

6 裂解多糖單加氧酶的應用

6.1 功能性食品

功能食品作為一種具有保健、防治疾病等功效的食品,近年來日益受到人們的重視。低聚果糖、低聚半乳糖等低聚糖作為益生元添加到食品中開發成功能性食品,不僅可以改善產品口感,而且具有調控腸道菌群和腸道微生態的潛力。LPMO與GH協同,可實現低聚糖的高效合成,在功能性食品領域極具潛力為人類健康提供新的思路。周頔等[46]觀察低聚果糖、低聚異麥芽糖、低聚木糖、低聚半乳糖4種低聚糖類益生元分別代替蔗糖對煉乳品質影響過程中,發現糖替代比15%的低聚異麥芽糖煉乳在滿足甜味的同時,又實現了減糖的目的,并且益生元的加入使其具有更多的功能性。在酸奶制作中添加乳果糖、菊粉作為益生元能夠減少貯存過程中活菌數的下降提升酸奶的品質,同時有效促進嗜熱乳桿菌和雙歧桿菌等益生菌的增殖,從而改善腸道健康[47]。姜雅杰等[48]開發的功能性殼寡糖復合固體飲料能夠改善糖尿病小鼠的腸道微生物群落結構,促進益生菌的增殖,減少病原菌,改善腸道健康,同時還能幫助小鼠降脂和穩定血糖。燕麥奶含有豐富的益生元低聚果糖,攝入后可提高腸道內短鏈脂肪酸(丁酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽)的生成,降低腸道 pH、氮終產物和糞便酶的量,并提高機體免疫力,促進骨生長[49]。

6.2 飼料添加劑

抗生素在動物飼料中的應用,不僅可以預防動物疾病,提高動物的健康水平,而且可以提高飼料利用率,還可以提高肉、蛋、奶的產量,大大推動了我國畜牧業的迅速發展。與此同時,也引發了許多新的問題,比如在飼料中加入抗生素,所帶來的藥物殘留危害非常明顯,因為抗生素的長期使用,會使致病菌的抗藥性變得更強,從而形成具有耐藥性的超級細菌。與此同時,還會對周圍的環境造成污染,進而對人體的健康造成威脅,同時2020年起全面禁止使用抗生素,人們開始尋找安全、有效的無抗飼料[50]。隨著人們的生活水平的不斷提升,食品安全問題受到了越來越多的重視,眾多益生菌、酶制劑如LMPO等添加到飼料中應運而生[51]。

非淀粉多糖(non-starch polysaccharides,NSP)是除淀粉外的一種多糖,其在飼料中具有顯著的抗營養作用,其在水中溶解后具有較高的黏度。然而,傳統飼料配料中含有的非淀粉多糖等抗營養因子及有毒物質,使其營養價值顯著降低,限制了其在生豬生產中的應用。研究發現[52-53],添加非淀粉多糖復合酶能顯著地提高了豬對飼料的吸收利用能力,并使其達到了較好的增重效果,同時也使總能量的表觀消化率得到了很大的提高。因此,在飼料中添加 LPMO及非淀粉多糖酶,可有效地降解NSP,解除NSP的抗營養作用[54]。同時還可產生功能寡糖類和其他有益物質,纖維寡糖作為纖維素的主要產物,聚合度為2～6的可溶性纖維寡糖可以促進雙歧桿菌(Bifidobacteria)、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacei)等腸道內益生菌的生長繁殖,不僅增強人體抵抗力,還改善腸道菌群結構和腸道發育以及使食糜黏度下降從而降低畜禽胃腸疾病的發生,可作為優良的家畜飼料促進畜禽的健康生長[55]。

6.3 生物能源

以木質纖維為原料的生物質資源是繼煤炭、石油、天然氣之后的一種新的可再生能源,是緩解人類日益嚴重的環境問題的重要途徑。木質纖維素經降解發酵可轉化為生物酒精,該過程分為2個步驟:首先將纖維素分解成單糖,再將單糖進行發酵,而這一過程的核心是降解為單糖階段。因此,開發廉價高效的木質纖維素降解酶,為其高效轉化利用提供理論依據和技術支持具有重要意義。R17LPMO和纖維素酶的協同作用對經過蒸汽爆破預處理過的玉米秸稈降解效果顯著提高,數據表示200 ℃預處理玉米秸稈3 min效果最好[56]。同樣的幾丁質在生物能源方面的利用和木質纖維素有著相同的處境,自然界中存在量大但是降解為人們所能利用是一個比較棘手的問題。研究表明具有幾丁質降解能力菌株(Chitiniphilussp. LY72)的裂解多糖單加氧酶(CsLPMO)和幾丁質水解酶之間有著協同的輔助性,可以有效地提高對固體幾丁質的水解效率,而且CsLPMO用量越大,對幾丁質降解的輔助性作用越顯著[57]。源于Natrialbaceaearchaeon中的NaLPMO10A作為甲殼素的C1氧化劑在溫度40 ℃、pH 9.0的條件下對幾丁質的糖化效率達到最高,同時也可以在高濃度粒子的極端條件下提升糖化[58]。

7 結論和展望

生物質是繼煤炭、石油和天然氣之后最重要的一種可再生能源,是解決全球氣候變化、環境污染和能源危機的重要途徑。在這些物質中,木質纖維素和幾丁質的儲量都比較大,它們可以被用來轉換成綠色的生物燃料和高附加值的化工原料,其高值化和資源化對于維持地球碳循環以及生物煉制行業的發展都有著非常重要的意義。LPMO可通過氧化性斷裂破壞纖維素晶體結構,增加糖苷水解酶的結合位點,是實現纖維素高效酶解的關鍵,是一種很有發展前景的纖維素降解酶。LPMO的發現也讓人們對降解結晶多糖有了新的認識,通過其與GH協同作用實現功能性低聚糖的合成,為功能性食品的開發及應用提供幫助。并且在飼料中添加LPMO和相關酶制劑可以降低非淀粉多糖等抗營養因子帶來的不利影響,保障畜禽的健康生長。雖然LPMO在降解木質纖維素和幾丁質等多糖中表現出較好的效果,但是在工業上產量、高活力以及穩定性等方面還存在不少的挑戰,相信在不久的將來可以解決這個問題,進一步推動其在功能性食品、飼料添加劑及生物燃料等方面的應用。