一個常染色體顯性遺傳低頻感音神經性聾家系聽力學及遺傳學特征分析*

孫藝 盧宇朱玉華程靜 李建忠冀飛 王榮光袁慧軍

目前常染色體顯性非綜合征型耳聾的致病基因位點已經排序到DFNA57[1]，定位了46個DFNA基因位點。非綜合征型耳聾主要影響高頻，低頻感音神經性耳聾(low frequency sensorineural hearing loss,LFSNHL)相對少見，僅有4個位點，DFNA1，DFNA6/14/38、DFNA11、DFNA54與LFSNHL有關。迄今為止，成功克隆致病基因的DFNA位點有21個，基因23個，其中與低頻聽力損失相關的僅有DIAPH、WFS1和MYO7A三個基因。本課題組收集了一個常染色體顯性遺傳性聾家系，發病初期表現為低頻感音神經性聾，現將其臨床聽力學及遺傳學特征以及應用微衛星標記對DFNA21個位點23個基因進行初步篩查的結果報道如下。

1 資料與方法

1.1家系資料的采集 先證者來自中國人民解放軍總醫院耳鼻咽喉-頭頸外科門診,此家系命名為BJ-L046家系。2009年4月由專業研究人員赴患者居住地現場采集臨床資料。調查中對尋訪到的28名家系成員進行了詳細問卷式調查、耳鼻咽喉?？茩z查、全身體格檢查及聽力學檢查 ,未尋訪到或已故成員情況由親屬補充敘述。調查問卷內容包括:姓名、性別、出生年月、永久居住地址、聯系電話、耳聾詳細病史、用藥史、既往史,以排除外傷、爆震、中耳炎、耳毒性藥物等所致聽力下降。該項目的倫理論證由解放軍總醫院倫理委員會完成,參加者均簽署了知情同意書(18歲以下成員由其父母代簽),并抽取 5～10 ml外周靜脈血用于基因組DNA的提取和后期研究。

1.2檢查方法 對全部家系成員進行純音聽閾檢查[Madsen 502 便攜式聽力計(丹麥) ,耳機為EAR - 3A 插入式耳機(美國)]；聲導抗檢查(Madsen 901，丹麥)；耳聲發射檢測(丹麥，Madsen CAPELLA)；聽性腦干反應檢測(Intelligent Hearing Systems SmartEP, America) 。應用溫度、前庭誘發性肌源性電位進行前庭功能檢查，對其中5名患者進行了耳聲發射、聽性腦干反應檢查，2名患者進行了前庭功能及顳骨CT掃描檢查。

1.3耳聾表型的分析判斷標準 參照Van Camp等2003年9月倡導的《關于非綜合征型遺傳性聾家系遺傳學及聽力學描述術語建議案》[2]：①根據是否伴有全身其他器官系統的異常分為非綜合征型聾、綜合征型聾; ②根據聽力損失的性質分為傳導性聾、感音神經性聾及混合性聾;③根據語言發育階段分為語前聾、語后聾；④根據聽力損失的頻率分為：高頻聽力損失型(2～8 kHz 聽力下降為主)、低頻聽力損失型(0. 25～0.5kHz聽力下降為主)、中頻聽力損失型(0. 5～2 kHz聽力下降為主)、全頻聽力損失型(0. 25～8 kHz 聽力下降)；⑤聽力損失程度按照兩耳中聽力較好耳的平均聽閾(0. 5～4 kHz 聽閾的平均值) 來評估: 20～40 dB HL為輕度聽力損失;41～70dB HL為中度，71～ 95 dB HL為重度; > 95 dB HL為極重度。

1.4選取微衛星標記(STR Marker)作為遺傳標記進行DFNA21個位點23個已知耳聾基因篩查

1.4.1微衛星標記的選擇 在http://genome.ucsc.edu/網站中查詢DFNA位點中已經克隆了的23個耳聾基因在染色體特定區域內的物理距離，在http://www.marshfieldclinic.org/research/pages/index.aspx網站中查詢并選取與每個基因物理距離最近的微衛星標記1～2個，對每個微衛星標記的上游引物的5’端用FAM熒光染料標記(上海英俊生物技術有限公司合成)。

1.4.2微衛星標記的分析流程 ①PCR擴增體系 5 μl反應體積內包含10 ng DNA, 每對引物0.000 25 nmoL, 0.25 U 的 HotStar Taq DNA 聚合酶 (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)，3 mmol的Mg2+以及0.32 μmoL dNTP；②PCR擴增條件 PCR儀采用 Veriti型 ( Applied Biosystems, USA)。熱循環條件采用“Touchdown”方式；③PCR擴增產物變性和上樣 將50 μl的GeneScanTM-400HD ROXTM Size Standard和900ul Hi-DiTM甲酰胺混合配制分子量內標混合液；每1 μl PCR擴增產物加入4 μl分子量內標混合液，PCR儀95℃變性5分鐘，迅速入冰，加入ABI 3130xl Genetic Analysis測序儀運行Gene Scan毛細管凝膠電泳；④微衛星標記分析 應用GeneMarker(version 1.65)軟件進行微衛星等位片段大小分析，同時進行人工檢查校正；分析結果輸入LINKAGE DESIGNER軟件分析后輸出*.pre、 *.dat、 *.mdf 參數文件；應用LINKAGE(5.1 version)軟件進行連鎖分析[3]，計算LOD值,LOD值≥3提示肯定連鎖，-2

2 結果

2.1BJ-L046家系的基本資料及家系譜圖 該家系五代居住于北京市,調查家系成員28人,年齡10～79歲。其中有11人被明確診斷為感音神經性聾;耳聾患者癥狀以耳聾、耳鳴為主,未見其他器官系統的異常。家系譜圖見圖1。家系患者Ⅲ：20有氨基糖苷類藥物用藥史，患者Ⅲ:9、Ⅳ:9有環境噪聲接觸史，BJ-L046家系每代的患病率見表1。通過家系的系譜圖分析可知，BJ-L046家系共5代，各代連續發病，每代中男女均可患病，男女發病比例為9∶5,現存患者分布于第II至第Ⅳ代，系譜圖中最初患者為女性(Ⅰ:2)，其后裔Ⅱ代的子女全部為耳聾患者，患病率達100%(表1)；第Ⅲ代共10個子女，其中6個患病，患病率達60%，第Ⅳ代共16個子女，其中4個患病，患病率為25%，其患病率下降可能由于其中第Ⅳ代成員Ⅳ：7、Ⅳ：12、Ⅳ：13及Ⅳ：17尚未到發病年齡而將其疾病狀態定為“不確定”所致；該家系每一代的耳聾發病年齡相似，在10～20歲(表2)，未見明顯逐代提前或延后的趨勢。由此可見，BJ-L046家系完全符合典型的常染色體顯性遺傳特點。

圖1 BJ-L046家系系譜圖

表1 BJ-LO46家系每代的患病率(例)

2.2BJ-L046家系中耳聾患者的聽力學特征 該家系現存11例患者表現為感音神經性聾，聽力損失程度從輕度到中、極重度不等，輕度為6例，中度3例，極重度2例，聽力損失呈上升型曲線4例，平坦-上升型4例，平坦型3例。聽閾及與年齡的關系：該家系耳聾表型特征為學語后的、遲發的、低頻聽力損失為主的漸進性聽力損失。家系中每代患者的平均發病年齡為10～20歲，11位患者的聽力損失程度與年齡的關系見表2,可見各代隨著年齡的增加,聽力損失程度逐漸加重,低頻(250～1 kHz)聽力損失可達重度。

表2 BJ-L046家系現存耳聾患者的聽閾及與年齡的關系

2.3典型病例 先證者Ⅲ:15，男,39 歲 ,出生后學語正常 ,28歲時發現聽力下降并伴有耳鳴 ,此后病情進行性加重 ,無眩暈等伴隨癥狀。純音測聽顯示呈低頻聽力損失為主的上升型聽力曲線，聽力損失程度為中度(圖2)。ABR測試結果示雙側I-V波間期正常，DPOAE檢查示右耳6.0～8.0 kHz可引出,其余頻率未引出，左耳各頻率均未引出，排除了聽神經病。前庭功能檢查雙側水平半規管功能正常；前庭誘發性肌源性電位檢查結果正常；顳骨CT掃描示內耳結構及發育正常,排除了內耳及神經的占位病變。

圖2 先證者Ⅲ:15聽力圖

病例Ⅱ：5，男，70歲，為家系患病成員中年齡第二大者，10歲前發現聽力下降，無耳鳴、眩暈等伴隨癥狀。純音測聽顯示患者中、高頻受累，表現為平坦型聽力曲線，聽力損失程度為極重度(圖3)?；颊撷螅?0，35歲，5～6歲出現聽力下降，25歲時因婦科炎癥有氨基糖苷類藥物用藥史，其聽力圖特點為平坦-上升型；患者Ⅲ：9，53歲，7歲出現聽力下降，30歲左右有環境噪聲接觸史，其聽力圖特點為平坦型-上升型；患者Ⅳ：9，23歲，18歲出現聽力下降，近2年有環境噪聲接觸史，其聽力圖特點為平坦-上升型，以上患者氨基糖苷類藥物用藥及接觸噪聲均在發病之后，聽力圖特點均為低頻聽力損失為主的平坦-上升型曲線，排除了藥物或噪聲所致耳聾的可能性?；颊撷簦?6，17歲，7歲時曾患急性中耳炎，已治愈，12歲出現聽力下降，檢查雙耳鼓膜完整，聲導抗檢查雙耳鼓室導抗圖為A型，其聽力損失為感音神經性耳聾，聽力圖特點為上升型，亦排除了中耳炎所致耳聾的可能性。

圖3 Ⅱ：5聽力圖

2.4DFNA位點23個耳聾基因篩查結果見表3。

表3 連鎖分析遺傳標記間的兩點LOD值

由表3可見對DFNA21個位點23個基因通過微衛星標記，數據連鎖分析計算LOD值，無陽性發現，可初步排除DFNA21個位點中已克隆的23個基因。

3 討論

DFNA1是第一個報道以低頻聽力下降為特征的家系。1981年，Leon[4]首次報道一個哥斯達黎加家系，患者表型特點為10歲左右發病，低頻聽力下降，進展迅速，30歲左右發展為極重度聾，并累及所有頻率。1992年Leon等[ 5]將該家系的致病基因定位于5q31，并命名為DFNA1。1997年，Lynch等[6]發現DFNA1家系的致病基因為DIAPH1,該基因是果蠅透明基因的同源體，其基因產物在肌動蛋白的聚合過程中起重要作用。

DFNA6/14/38[7～10]定位于4p16.3，其致病基因為WFS1，該基因可導致Wolfram綜合征，目前認為WFS1基因是常染色體顯性遺傳LFSNHL的常見原因，但并不是散發LFSNHL患者的常見發病因素[11]。DFNA6/14/38患者的聽力損失特點與DFNA1不同，進展緩慢，患者老年時的聽閾仍能維持在80 dB HL左右，不會發展成極重度聾。

DFNA11定位于11q13.5，其致病基因為MYO7A，該基因是遺傳性聾的“明星基因”，迄今為止已經有90多種MYO7A基因突變可以引起聽力下降，這些突變分布于基因的全長，大多數突變能引起Usher綜合征1B和不典型Usher綜合征，部分突變引起非綜合征型常染色體顯性遺傳性聾(DFNA11)、常染色體隱形遺傳性聾(DFNB2)。1997年Liu[12]等報道了第一個DFNA11家系，近10年共報道了5個DFNA11家系。在目前已報道的5個DFNA11家系中有2個家系的聽力損失表型特征為低頻感音神經性聾，2004年Luijendijk等[13]報道的荷蘭家系發病年齡為4～43歲，聽力圖特點為上升型，6例患者中4例出現輕度的前庭功能障礙及隱匿的視覺功能障礙。同年Street等[14]報道的美國家系發病年齡介于20～30歲之間，聽力圖特點為上升型，無前庭功能及視覺功能障礙。

2004年，Gurtler等[15]將一個瑞士低頻感音神經性聾家系的致病基因定位在與DFNA15重疊的區域，命名為DFNA54，其致病基因目前尚未見報道。該家系臨床表型特點為發病年齡5～40歲，進展緩慢，聽力損失為輕度到中度，有兩例患者偶有眩暈。

本研究的BJ-L046家系遺傳性聾家系圖譜分析表現為一種常染色體顯性的遺傳方式,為學語后、遲發的、漸進性、低頻聽力下降為主的表型特征。該家系共5代，各代連續發病，每代中男女均可患病，男女發病比例為9∶5，早期以低頻損失為主，發病時即表現為輕、中度聾，至老年時才發展至極重度聾，聽力曲線早期呈上升型，逐步發展呈平坦型。該家系平均發病年齡各代相似，未見明顯逐代提前或延后的趨勢。由此可見，BJ-L046家系完全符合典型常染色體顯性遺傳特點。

目前，遺傳疾病的研究手段包括功能克隆、表型克隆以及定位克隆。針對本研究報道的BJ-L046家系，選用了定位克隆的研究方法，應用連鎖分析(linkage analysis)方法確定耳聾基因在染色體上的未知位置。家系連鎖分析方法通過假定遺傳模式來決定遺傳標記是否與疾病位點連鎖。目前最常用的是Lods法 ,即對數優勢計分法。對BJ-L046家系的研究策略為首先確認該家系是否與已知DFNA位點相連鎖，致病基因是否為已知基因，如果不連鎖，提示可能是新的位點，致病基因可能是新的耳聾基因。本研究選取微衛星標記(STR Markers)作為遺傳標記篩查DFNA位點中已經成功克隆致病基因的位點21個，基因23個，根據以上連鎖分析判定方法，無陽性發現，除了與低頻聽力損失相關的三個基因DIAPH、WFS1和MYO7A均已被初步排除以外，其它DFNA已知基因也初步被排除。下一步將通過基因芯片技術對家系成員進行全基因組掃描染色體定位，并進一步在定位區域內確定耳聾基因，有望發現新的與低頻感音神經性聾相關的基因。

4 參考文獻

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