低糖低氧對神經干細胞增殖和代謝的影響＊

趙 彤,黃 欣,朱玲玲,熊 雷,張 寬,吳麗穎,劉 兵,吳奎武△,范 明△

(1.軍事醫學科學院基礎醫學研究所腦保護與可塑性研究室,北京 100850;2.軍事醫學科學院307醫院,北京 100850)

神經干細胞(neural stem cell,NSCs)是1992年Reynolds等從成年鼠紋狀體分離出能在體外不斷分裂增殖,具有多種分化潛能的細胞群,并提出了NSCs的概念,即一類具有自我復制更新能力、高度增殖和多向分化潛能的細胞[1]。目前被廣泛應用于細胞移植和基因治療載體的研究。神經干細胞的移植為腦組織損傷的修復治療提供了有效的手段。

成年動物腦內神經發生主要存在兩個區域:一個位于側腦室的腦室下區(SVZ),該區域能產生新的內源性干細胞,并沿喙側遷移流遷移至嗅球;另一區域為海馬齒狀回(DG)的顆粒下層(SGZ),SGZ的干細胞可發育形成新的顆粒細胞[2-3]。近年來的研究發現間歇性低氧處理可促進這種內源性神經干細胞的增殖;腦缺血也可以顯著促進成體SVZ和DG的神經再生[4];另一方面,在體腦組織處于一種相對低氧的環境中,平均氧含量為1%～5%,甚至更低。這種低氧或低糖的微環境是如何影響神經干細胞增殖和代謝的,目前尚不知曉。因此,本研究利用體外培養的神經干細胞觀察低糖、低氧對大鼠神經干細胞增殖和代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

SD孕大鼠(E13.5 d)由北京大學醫學院動物中心提供;細胞培養基DMEM/F12(高糖12100-038、低糖 31600-026、F1221700-026,G ibco 公司)、N2、B27(G ibco公司);表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF,Promega公司);細胞葡萄糖、乳酸、丙酮酸濃度測定(301醫院生化科)。

1.2 NSCs分離培養和鑒定

戊巴比妥鈉(1 mg/100g bw)腹腔注射麻醉SD大鼠,取出胚胎,解剖鏡下分離中腦,去除腦膜和血管,0.125%胰酶37℃消化30min,終止消化后,將組織吹打懸浮成單細胞,加入相應的細胞培養液(高糖/低糖 DMEM/F12+20ng/L EGF、bFGF+1%N2、B27、谷氨酰胺和雙抗),以1×106cells/ml密度接種于25 cm2的細胞培養瓶中,37℃、5%CO2孵箱培養,3-5 d后傳代。傳至第三代進行以下實驗研究。

1.3 不同葡萄糖濃度和低氧條件及分組

實驗采用不同葡萄糖濃度的培養液培養以及不同的氧濃度處理:高糖(4.5 g/L,HG)、低糖(1.4 g/L,LG);常氧 (20%O2)、低氧 (3%O2,Thermo 3111,Billups-Rothenberg,Del Mar,CA)NSCs在不同糖濃度下培養至第三代進行低氧處理,分為四組:低糖常氧(Low glucose+Normoxia,L+N)、低糖低氧(Low glucose+Hypoxia,L+H)、高糖常氧(High glucose+Normoxia,H+N)、高糖低氧(High glucose+Hypoxia,H+H);培養 1 d、3 d、5 d 后進行實驗。

1.4 CCK-8檢測神經干細胞增殖

細胞以 3×104cells/well接種于 96孔板(Costar),每組接種20孔,置于常氧或低氧條件下培養1 d,3 d,5 d,每孔加入10μl cell counting(細胞計數試劑盒CCK-8,日本dojindo),4h后采用酶聯儀檢測,波長450nm的吸光度值。

1.5 生化分析儀測定細胞培養上清中葡萄糖、乳酸、丙酮酸濃度

細胞以5×105cells/well接種于35 mm培養皿(Costar),每組接種3皿。處理結束后收集細胞,600r/min離心4 min,利用全自動生化分析儀(HITACHI-7600,日本)測定各組細胞培養上清液中葡萄糖、丙酮酸和乳酸濃度,實驗重復3次。

1.6 RT-PCR檢測代謝相關酶的表達

細胞以 5×104cells/well接種于培養瓶中(Costar),分別置常氧和低氧條件下培養3 d,提取總RNA進行半定量RT-PCR檢測,總RNA提取及RTPCR操作過程按試劑盒說明進行。以18S RNA為內參,PCR條件為94℃30s,60℃1 min,68℃2 min,30個循環,68℃7 min。引物序列為:葡萄糖轉運蛋白4(glucose transporter,G LUT4:Sense:5’GGCTGTG AGTG AGTGCTTT3’;Anti-sense:5’ GGTTTCTGCTCCCTATCGT 3’;54℃424 bp)。葡萄糖激酶 (glucokinase,GK:Sense:5’ GTG AGGTCGGCATG ATTG 3’,Antisense:5’CCACTTGTG ACACG AAACG 3’,56℃ 357 bp);丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK:Sense:5’G ATGTGG ATCG AAGGGTC 3’,Anti-sense:5’GGTTG AAAG AAATAGGGTGTA 3’,53℃191 bp);乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,LDH:Sense:5’ACAAGG AGCAGTGG AAGG 3’,Anti-sense:5’GG ACGCTG AGG AAG ACAT 3’,58℃206 bp)。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 低糖低氧對神經干細胞增殖的影響

低糖和高糖培養基培養的NSCs在常氧(20%O2)和低氧(3%O2)條件下分別培養1 d,3 d,5 d后,用CCK-8檢測神經干細胞的增殖。結果表明:低糖或高糖組培養的神經干細胞在低氧后3 d和5 d細胞的增殖都比常氧組有明顯增加(低糖低氧vs低糖常氧:3 d 1.31±0.0537vs0.5745±0.0488;5 d 3.1401±0.171vs1.7525±0.102;高糖低氧 vs高糖常氧:3 d 1.17±0.0823vs0.416±0.0226;5 d 3.1086±0.1799vs 1.1907±0.0582;P<0.05);而在常氧條件下,低糖組較高糖組的NSCs的增殖在第5天時更為明顯(低糖常氧:1.7525±0.102高糖常氧:1.1907±0.0582;P<0.05)。表明低糖或低氧均能促進NSCs的增殖,低氧低糖或低氧高糖的作用尤為明顯(圖1見下頁)。

2.2 低糖低氧對細胞培養上清液中葡萄糖、乳酸、丙酮酸濃度的影響

Fig.1 E ffect of low oxygen and/or low glucose on the proliferation of neural stem cellsin vitro L+N:Low glucose+normoxia;L+H:Low glucose+hypoxia;H+N:High glucose+normoxia;H+H:High glucose+hypoxia

低氧和低糖均能在一定程度上促進神經干細胞的體外增殖,那么該條件下細胞的代謝又發生怎樣的變化呢?我們將低糖和高糖培養基培養的NSCs在常氧(20%O2)和低氧(3%O2)條件下分別培養1 d,3 d,5 d后,進一步利用生化分析儀分別測定各組細胞培養上清液中葡萄糖、丙酮酸、乳酸的濃度。結果如圖所示:(1)低糖低氧對神經干細胞培養上清液中葡萄糖濃度的影響:隨著培養時間的延長,各組細胞培養上清液中葡萄糖濃度有不同程度的下降,高糖常氧組變化很小,只在低氧5 d后才有所下降(高糖常氧:1 d 18.4967±0.2538,3 d 18.4467±0.6269,5 d 17.64±0.4349;P<0.05);而低糖組在合并低氧后,葡萄糖濃度下降速率最為顯著(低糖低氧:1 d 9.1875±0.1682,3 d 4.02±0.1757,5 d 0.01±0.01;P<0.05,圖 2)。(2)低糖低氧對神經干細胞培養上清液中丙酮酸濃度的影響:細胞培養1 d時,低糖處理組的丙酮酸含量都明顯高于高糖處理組(低糖低氧 vs高糖低氧:7.3425±0.0885vs3.2367±0.125;P<0.05),培養至5 d時,低糖處理組丙酮酸濃度迅速下降(低糖常氧 vs高糖常氧:5 d 1.145±0.1812vs0.21±0.0751;P<0.05),以低糖低氧組最為明顯(低糖低氧 vs高糖低氧:3 d 3.56±0.0589vs2.3833±0.125;5 d 0.21±0.21vs0.65 ±0.0872;P<0.05,圖 3)。(3)低糖低氧對神經干細胞培養上清液中乳酸含量的影響:低糖低氧處理1 d后,低糖組細胞培養上清液中乳酸的含量均高于高糖組,3 d時,各組乳酸含量均有增加,而低糖低氧組增加的幅度最大;培養至5 d時,高糖低氧組含量也有了明顯的升高。但高糖組細胞培養上清液中的乳酸含量明顯低于低糖組 (表1見下頁)。因此,細胞在低糖低氧環境下培養時,細胞的代謝發生明顯的變化,特別是糖酵解明顯加強,丙酮酸和乳酸的產生明顯增加,并隨著培養時間的延長,對葡萄糖和丙酮酸的利用增加而導致細胞培養上清液中葡萄糖和丙酮酸的濃度逐漸減少。

Fig.2 G lucose conctration in the media of neural stem cells under low oxygen and/or low glucose

Fig.3 Pyruvic acid concentration in the media of neural stem cells under low oxygen and/or low glucose

2.3 低糖低氧對神經干細胞中代謝相關酶表達的影響

既往的研究表明在低氧促進神經干細胞增殖過程中,低氧誘導因子HIF1是關鍵的調控因子,我們進一步檢測了與代謝相關的HIF1的靶基因表達的變化。神經干細胞在不同的條件下培養3 d后,用RT-PCR的方法檢測代謝相關的酶,如葡萄糖轉運蛋白4(G LUT4)、葡萄糖激酶 (GK)、丙酮酸激酶(PK)、乳酸脫氫酶(LDH)的表達(圖4見下頁)。結果顯示:在低糖或低氧時,G lut4和PK的表達明顯高于對照組。以上結果表明,低氧能促進NSCs的增殖,而以低氧和低糖共同作用時更為明顯;在低氧低糖條件下,細胞的代謝發生變化,葡萄糖的利用明顯增加,主要通過糖酵解途徑代謝產能。

3 討論

本研究探討了低氧和低糖對體外培養神經干細胞增殖和代謝的影響。主要作用如下:(1)低氧或低糖都可促進神經干細胞的增殖;(2)低氧和低糖或高糖共同作用一定的時間,促進神經干細胞的體外增殖更為明顯;(3)在低氧和低糖條件下,神經干細胞的代謝發生明顯變化,葡萄糖的利用增加,丙酮酸和乳酸的產生增加,主要通過糖酵解代謝途徑。

Tab.1 Effect of low oxygen and/or low glucose on the lactic acid content(,n=3)

Tab.1 Effect of low oxygen and/or low glucose on the lactic acid content(,n=3)

＊P<0.05vsnormoxia;#P<0.05vslow glucose; △P<0.05vs1 d; ▲P<0.05vs3 d

Time L+N H+N L+H H+H 1 d 0.565±0.010 <0.5 0.798±0.017＊ <0.5#3 d 2.943±0.065△ 1.227±0.012#△ >12＊ 3.26±0.065＊#△5 d 9.740±1.075△▲ 3.650±0.006#△▲ >12＊ >12＊△▲

Fig.4 Representative photography of G lut4,PK,GK and LDH expression in neural stem cells under low oxygen and/or low glucose

目前對于神經干細胞的體外培養都是在常氧(20%O2)和高糖等充分的營養的條件下進行的[5],但這和細胞在體的環境完全不同,如在成年哺乳動物大腦,組織間隙的氧含量約1%～5%,其他區域組織的含氧水平甚至更低[6];特別是腦缺血后引起的組織缺糖缺氧也是利用神經干細胞移植治療損傷所面臨的微環境。因此,在該研究中,神經干細胞在單純低糖條件下,在培養的第3,5天時細胞的增殖較高糖組明顯;加上低氧(3%O2)環境后,在低糖或高糖和低氧的環境中,神經干細胞的增殖更加明顯。同樣地,細胞在低糖或低氧環境中,代謝都發生了明顯的變化,細胞在低氧的環境中主要利用葡萄糖進行糖酵解途徑代謝產能,如圖3所示,在低糖低氧環境中培養液中的葡萄糖含量明顯降低,到培養第5天時幾乎降為零;而在高糖環境中,培養液中的葡萄糖含量從培養第5天才開始下降;與此相對應,培養液中丙酮酸含量低氧組較常氧組都明顯增加,但隨著培養時間的延長而逐漸減少;乳酸的含量則逐漸增加。對體外培養的神經干細胞,雖然低糖和低氧都能在一定的程度上促進其增殖,但由于細胞主要依賴葡萄糖酵解產能,因此,在高糖環境中更能提供足夠的葡萄糖而維持細胞持續的增殖。

低氧誘導因子HIF-1是細胞在低氧時關鍵的調控因子之一,目前發現受其調控的靶基因有60多個,這些基因產物在調節細胞增殖分化、能量代謝、血管重塑等方面發揮了重要作用[7]。我們既往的研究顯示,低氧誘導因子HIF1是低氧促神經干細胞增殖的關鍵調節因子,在低氧促神經干細胞增殖過程中低氧誘導因子(HIF1)的表達增加[8];這里我們用RT-PCR的方法檢測了其下游的影響細胞代謝的相關基因的表達,如葡萄糖轉運蛋白4(G luT4)、丙酮酸激酶(PK)和乳酸脫氫酶(LDH)。結果表明:在低糖或低氧時G lut4和PK的表達也明顯高于對照組。以上結果表明,低氧和低糖通過增加葡萄糖的轉運,以及糖酵解途徑中丙酮酸激酶的表達,來調節低氧低糖的環境中神經干細胞的代謝發生變化。因而,認識低氧和低糖作為一種有效的刺激信號在調節神經干細胞增殖和代謝中的作用,對于臨床某些疾病的治療提供了新思路。

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