甲真菌病的3種實驗診斷方法研究

胡記妹，曾軍榮，梁海燕，鄺家熙

（廣東省從化市中心醫院檢驗科，廣東從化 510900）

甲真菌?。╫nychomycosis）是南方地區最常見的甲病，通常認為甲真菌病在人群中的發病率為3%～5%[1]，占真菌病的20%～30%[2]。甲屑直接鏡檢和真菌培養是公認的診斷甲真菌病的“金標準”，但受取材的質和量等因素的影響，兩者結合診斷的陽性率＜70%[3]。近年來開展了剪取病甲做組織病理學檢查[4]及PCR檢測[5]，使查菌的陽性率得以提高，但卻存在制作復雜、耗時長等缺點，限制了它們的推廣。臨床上迫切需要一種準確、簡便、快速、價廉、易行的方法用于甲真菌病的診斷。為探索一種操作簡易、實驗結果可靠的檢驗方法診斷甲真病，筆者采用20%KOH浸軟病甲真菌鏡檢（簡稱浸軟法）從甲標本中檢測真菌，并與直接鏡檢法、真菌培養法（簡稱培養法）進行比較。

1 資料與方法

1.1 一般資料

121例均為2006年9月～2009年10月來我院皮膚科門診就診的患者，入選患者均符合甲真菌病的診斷標準[6]。其中，男 59例，女 62例；年齡 17～65歲，病程 30 d～24年，平均4.2年。觀察病甲數目432份，靶甲數目121份，伴手足癬38例，有甲板外傷史12例。受檢前1個月內均未接受過局部和系統抗真菌藥物治療。

1.2 標本采集

以75%酒精消毒病甲表面后，用消毒手術刀刮棄表層甲屑，刮取和剪取擬診為甲真菌病的靶甲及甲下碎屑，分為3份，其中，81份病甲標本取自遠端側緣甲下型，40份取自全甲毀損型。

1.3 方法及判斷標準

刮取其病甲遠端邊緣和甲床皮屑進行傳統的KOH直接鏡檢[6]，同時剪取病損指、趾甲末端少許標本做浸軟法真菌鏡檢和真菌培養。3份標本分別按下述3種方法處理：

1.3.1 直接鏡檢法 取刮下甲屑于載玻片上，加10%KOH 1滴溶解，10 min后觀察，Olympus光學顯微鏡下見菌絲和（或）孢子者為陽性。皮膚癬菌：菌絲較細、規則、分隔、分枝，可見關節孢子。酵母菌：可見酵母細胞團、芽生孢子及假菌系。真菌：菌絲粗大，不規則，可見特殊結構。

1.3.2 培養法 采用兩管法，即甲屑同時接種于含氯霉素和放線菌酮的沙氏培養基與含氯霉素、不含放線酮的沙氏培養基（以上培養基均為自制），每管最少接種3點，置25～27℃培養，隨時觀察培養情況。4周以上無菌落生長判定為陰性，有菌落生長者，皮膚癬菌及真菌的鑒定主要依據菌落形態、顏色等以及Olympus光學顯微鏡鏡檢鑒定，鑒定標準參照《醫學真菌學——實驗室檢驗指南》[7]，念珠菌屬用API20cAux試劑盒（法國BioMerieux公司）鑒定到種。

1.3.3 浸軟鏡檢法 將病甲標本置入20%KOH溶液中56℃40～50 min，待病甲標本完全浸透軟化呈蛋白胨狀，吸出多余的KOH液后，將標本放在載玻片上，用蓋玻片輕輕將標本壓平、壓薄呈云霧狀或毛玻璃狀，在Olympus光學顯微鏡下見菌絲和（或）孢子者為陽性。皮膚癬菌：菌絲較細、規則、分隔、分枝，可見關節孢子。酵母菌：可見酵母細胞團、芽生孢子及假菌系。真菌：菌絲粗大，不規則，可見特殊結構。

1.4 統計學方法

采用SPSS 13.0軟件分析，行χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 直接鏡檢法結果

121例擬診患者甲標本中，真菌陽性者58例（47.9%）。

2.2 培養法結果

121例擬診患者甲標本培養出72例（59.50%）共80株真菌，單一感染69例（95.83%），混合感染3例（4.17%）。菌種分布情況見表1。

表1 121例甲真菌病真菌培養結果Tab.1 The results of 121 onychomycosis by fungal culture

2.3 浸軟鏡檢法

121例擬診患者甲標本中，118例（97.52%）檢出真菌成分，檢查結果：孢子、菌絲形態初步提示為皮膚癬菌110例（91%），初步提示為酵母菌36例（30%），初步提示為真菌48例（38%）。其中2種或2種以上真菌混合24例。

3種方法檢出結果見表2。

表2 121例疑甲真菌病3種方法檢查結果[n(%)]Tab.2 The results of 121 onychomycosis by three tests[n(%)]

三種方法檢出率差異有高度統計學意義（χ2=75.247，P＜0.001），直接鏡檢法與培養法檢出率差異無統計學意義（χ2=3.258，P＞0.05）。浸軟法鏡檢檢出率高于直接鏡檢法，兩者比較，差異有高度統計學意義（χ2=51.829，P＜0.001）；浸軟法檢出率高于培養法，兩者比較，差異有高度統計學意義 （χ2=75.00，P＜0.001）。

3 討論

甲真菌病指甲板、甲床和甲周圍組織的真菌感染，國內發病率約為15.6%[8]，是皮膚科常見病、多發病，但誤診、漏診患者時有發生，在系統治療前，采用切實可行的診斷方法證實甲真菌感染十分重要。筆者采用直接鏡檢法、真菌培養及浸軟鏡檢法進行了對比研究，結果顯示，浸軟鏡檢法明顯高于直接鏡檢法和真菌培養，與文獻報道一致。

雖然傳統的KOH直接鏡檢法和真菌培養操作簡單，但陽性率較低，分別為50%～75%和25%～80%[9]，容易出現假陰性；組織病理法陽性率為99.44%[10]，但要求條件高、操作復雜、時間長。直接鏡檢檢出率較低，本研究中直接鏡檢檢出58例（47.9%），但該方法快速、方便，可直接明確有無真菌感染。真菌培養雖為診斷甲真菌病的“金標準”，但是由于無活性休眠菌絲及甲標本暴露于空氣中，污染機會較多，影響結果的準確性，造成培養陽性率低。培養法耗時雖較長，但可鑒定菌種，進行藥敏試驗對藥物的選擇有一定的指導意義，如克柔念珠菌對氟康唑天然耐藥。組織病理法陽性率高于直接鏡檢和培養法，能觀察到真菌在甲中寄生的狀況，可對病原菌作出初步分類，并可對銀屑病等病甲明確診斷，但要求條件高、操作復雜、時間長，因真菌在病甲內分布稀疏不均，往往需要多層面切片尋找方可避免假陰性結果，鏡下菌體往往呈橫斷面或節段狀，還需特殊染色（PAS染色）方易區別，甲切片對切片刀磨損大，制片過程需1周，對實驗人員的實驗組織病理學技術要求較高，使該法推廣受限。浸軟法真菌鏡檢與甲組織病理法比較，具有患者無痛苦、操作簡便、經濟、快速、鏡下病甲內的真菌生長形態完整、無需特殊染色、低倍鏡下即可觀察到病甲內原始狀分布的菌絲或關節菌絲的特點。張文娟等[11]提出應用KONCPA法診斷甲真菌病，筆者對此法進行了研究，20%KOH浸軟鏡檢法是一種檢出率高、可行性強的甲真菌病診斷方法。結果提示，組織病理學檢查和20%KOH溶甲法可彌補甲真菌病診斷中真菌直接鏡檢和真菌培養法的不足，顯著提高診斷陽性率和準確率。該法較甲病理法[9]診斷甲真菌病簡便、快速，易于操作，門診患者可無需固定步驟，制作濕片即可行鏡下觀察出報告，完成1份標本所需時間為1 h左右，在日益繁忙的皮膚性病科門診中具有推廣價值，建議臨床推廣應用。

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[5]李筱芳,田偉,王紅,等.多重PCR快速診斷甲真菌病[J].國際皮膚性病學雜志,2007,33(4):197.

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[11]張文娟,蔡永明,桑菊花,等.改良KONCPA法診斷甲真菌病的研究[J].中華醫學檢驗雜志,1997,20(4):254.