膠質細胞源性神經營養因子基因轉染雪旺氏細胞的實驗研究

杜文彥,王景宏,劉欽毅,鄭長軍*

(1.佳木斯大學附屬第一醫院 骨科,黑龍江 佳木斯 154002;2.吉林大學第二醫院 骨科,吉林 長春 130041)

膠質細胞源性神經營養因子基因轉染雪旺氏細胞的實驗研究

杜文彥1,王景宏1,劉欽毅2,鄭長軍2*

(1.佳木斯大學附屬第一醫院 骨科,黑龍江 佳木斯 154002;2.吉林大學第二醫院 骨科,吉林 長春 130041)

目的應用膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)基因轉染雪旺氏細胞,觀察GDNF基因在雪旺氏細胞內的表達效果,以及對雪旺氏細胞的營養作用。方法將雪旺氏細胞分為空白對照組、載體組、空載體組,通過陽離子脂質體介導,將GDNF基因轉染雪旺氏細胞。用細胞增殖實驗(MTT)、免疫組化、流式細胞儀觀察在 24 h、48 h、72 h各組轉染后對細胞的營養作用。結果在載體組細胞的生長狀況較其他兩組增殖良好。免疫組化可見GDNF在載體組細胞內呈現高表達。流式細胞儀觀察基因轉染后對雪旺氏細胞有明顯的營養作用。結論GDNF基因轉染雪旺氏細胞后,在細胞內呈現高表達,并對細胞有明顯的營養作用。

雪旺氏細胞;膠質神經源性神經營養因子(GDNF)基因;轉染

Q785

A

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0020)

脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)是一種嚴重的神經系統創傷性疾病,神經損傷后可導致神經元死亡、局部瘢痕形成等一系列病理變化。神膠質細胞源性神經營養因子及雪旺氏細胞對神經損傷后的修復起到重要作用,但是二者單獨應用于神經損傷的修復治療有其局限性,我們將膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)基因導入雪旺氏細胞,觀察GDNF的表達和對細胞的營養作用。

1 材料和方法

1.1 材料

雪旺氏細胞(吉林大學口腔醫學院生物工程實驗室提供)。倒置顯微鏡(OLYMPUS公司);離心機(長沙湘儀公司);流式細胞儀(BD公司);高速冷凍離心機(Eppendorf公司);-80℃冰箱(三洋公司)。MTT(Sigma公司);DMEM(GIBCO公司);GDNF抗體(ADL公司);SP免疫組化試劑盒(福州邁新公司);LipofectamineTM脂質體轉染試劑盒(Gibco公司)

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 將構建的重組質粒pEGFP-N1/GDNF和質粒pEGFP-N1分別通過脂質體轉染法導入純化培養的雪旺細胞,同時設立空白對照組,以觀察SCs的GDNF的表達情況。其中空白對照組:不做轉染的SCs;空載體組:將質粒pEGFP-N1轉染導入SCs;實驗組:將重組質粒pEGFP-N1/GDNF轉染SCs。

1.2.2 質粒的制備 將攜帶實驗組和空載體組的質粒接種在含有選擇抗菌素的平皿上,培養成功后,在兩組分別取出100 U至20 ml的LB液體培養基中,在37℃過夜震蕩培養16-18小時。將培養好的菌液收集于離心管內,于4℃5 000 rpm離心15 min,棄上清。加0.1倍體積3 M醋酸鈉(pH4.6)混勻后冰浴靜止放置30 min以上。于4℃4 000 rpm離心15 min,棄上清。加無DNA酶的RNA酶(10 mg/ml)于上清液中,在37℃下培養30min。加等體積的酚:氯仿:異丙醇(25∶24∶1)混合液搖勻,于 4℃5 000 rpm離心10 min,加等體積95%乙醇,-20℃下放置30 min,于20℃5 000 rpm離心10 min,棄上清。加入等體積13%聚乙二醇溶液8 000(1.6 M/NaCl),在4℃下靜置過夜。離心10 min,4℃下10 000 rpm,棄上清。用70%冷乙醇洗滌并抽干,于-80℃儲存備用。

1.2.3 雪旺細胞的培養 從液氮罐中取出凍存管中的SC,放入37℃恒溫水箱迅速復溫,并不斷搖動,使之迅速融化,待融化后,轉移至75 ml培養瓶內,800 r/min離心5 min,棄上清。加入含10%高糖DMEM培養基至5 ml,在37℃,含 5%CO2的飽和濕度的CO2細胞培養箱中培養24 h,更換新鮮培養液。待貼壁細胞達80%-90%左右時采用胰酶消化法按1∶4傳代,觀察細胞生長狀態良好時,準備轉染。

1.2.4 細胞的轉染 取對數生長期的細胞,胰酶消化,調細胞濃度為2×105,分別接種于6孔培養板,每孔2 ml。置37℃、5%CO2溫箱培養使細胞貼壁,培養6-24小時。觀察細胞密度達80%時,進行下列操作。取一Ep管,空載體組與載體組分別取5 μ g質粒,加無血清、無抗生素培養基至97 μ l,空白對照組直接加無血清、無抗生素培養基至 97 μ l,取 3 μ l脂質體加入到上述混合液中。振蕩混勻或漩渦混勻2 s,室溫孵育15 min。用無血清、無抗生素培養基洗細胞2次,加無血清、無抗生素培養基,將上述混合液加至培養液表面,充分混勻,注意不能濺到培養板蓋上。8小時后,更換完全培養基。72小時后熒光顯微鏡檢測

1.3 觀察指標

倒置顯微鏡下觀察細胞的轉染效果;用MTT方法檢測轉染后細胞的生長情況;用免疫組化觀察轉然后的雪旺氏細胞中的GDNF表達情況;用流式細胞儀檢測轉染后細胞的細胞周期,觀察細胞增殖情況。

1.4 統計學處理

全部數據采用Excel軟件包進行統計分析和處理,每兩組數據間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 倒置顯微鏡下觀察轉染細胞效果

轉染24 h后開始行倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光表達強度。轉染24 h后,可見空白對照組未見熒光細胞表達?？蛰d體組和載體組雪旺細胞在熒光顯微鏡下發出綠色熒光。至培養72 h,高倍顯微鏡下可見空載體組和載體組綠色熒光亮度增強(圖1),表明細胞轉染效果較好。

圖1 倒置顯微鏡下質粒轉染SCs細胞的熒光表達

2.2 MTT檢測結果

在用MTT方法檢測三組(空白對照組、空載體組、載體組)細胞24小時、48小時、72小時的生長狀況顯示:24小時時細胞生長狀況無明顯的變化,48小時空載體組細胞數減少,這說明單純的脂質體轉染對細胞有一定的毒性作用。在72小時載體組的細胞數量與空白對照組及空載體組比較有明顯差異(P＜0.01)。說明GDNF轉染雪旺氏細胞對細胞有明顯的營養作用,見表1。

2.3 免疫組化檢測結果

免疫組化染色72小時后鏡下觀察顯示:空白對照組和空載體組SCs胞漿內有淺棕色免疫復合物沉積,而載體組的SCs中胞漿內有深棕色免疫復合物沉積(圖2),表明GDNF基因在SCs中成功表達,且載體組GDNF的表達較空白對照組和空載體明顯增多。

2.4 流式細胞儀檢測結果

在用流式細胞儀方法檢測三組(空白對照組、空載體組、載體組)細胞24小時、48小時、72小時的 S期細胞增殖情況見表2。

表1 不同時間各組細胞增殖實驗檢測結果

圖2 鏡下質粒轉染SCs細胞的免疫組化圖

表2 不同時間各組流式細胞儀檢測結果

3 討論

膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)是由1993年Lin等[1]首先發現的蛋白質因子,是從大鼠膠質細胞系B49的無血清培養基中經濃縮、分離純化出來的。初期研究發現GDNF對中腦的多巴胺能神經元有較高的營養作用,隨著研究的深入發現GDNF家族成員對運動神經元具有營養作用?？梢宰柚贵w內運動神經元退變,對脊髓運動神經元起保護作用[2]。通過實驗研究表明,GDNF是現階段神經營養因子中作用最強的[3-5]。GDNF基因已經廣泛的應用于神經損傷后的修復的基礎實驗中。實驗證明了由于腦脊屏障的存在,單純的GDNF治療受到明顯限制。

雪旺氏細胞(Schwann cells,SCs)可以分泌多種神經營養因子,在周圍神經損傷后的修復中具有重要作用。雖然雪旺氏細胞對神經損傷的修復有較強的營養作用,但是單純雪旺氏細胞移植治療很難穿越星形膠質細胞形成的瘢痕區域。這是由于單純SC移植神經營養因子分泌量不足、且分泌具有時效局限性及在損傷脊髓的膠質瘢痕中存活不良所致,因此單純SC移植治療神經損傷很難達到理想的效果。

在我們的實驗中,我們通過陽離子脂質體介導,將膠質細胞源性神經營養因子基因轉入雪旺氏細胞中,形成基因修飾的雪旺氏細胞,觀察基因在雪旺氏細胞中的表達效果以及神經營養因子對雪旺氏細胞的營養作用。實驗結果表明,通過陽離子脂質體將重組質粒pEGFP-N1/GDNF轉入雪旺氏細胞中,能夠高效表達膠質細胞神經營養因子,表達的神經營養因子對雪旺氏細胞具有明顯的營養作用,對進一步應用基因修飾的雪旺氏細胞移植治療脊髓損傷打下堅實的基礎。相信隨著相關研究的深入,脊髓損傷治療的效果能夠得到進一步提高。

[1]Lin LF,Doherty DH,Lile JD,et al.GDNF:a glial cell line derived neurotrophic factor for midbrain dopaminerigic neurons[J].Science,1993,260(5111):1130.

[2]Milbrandt J,Desauvage FJ,Fahrner TJ,et al.Persephin,a Novel Neurotrophic Factor Related to GDNF and Neurtuin[J].Neuron,1998,20:245.

[3]Kasahara K,Nakagawa T,Kubota T.Neuronal loss and expression of neurotrophic factors in a model of rat chronic compressive spinal cord injury[J].Spine,2006,1531(18):2059.

[4]Lim PA,Tow AM.Recovery and regeneration after spinal cord injury:a review and summary of recent literature.Ann Acad Med Singapore[J].2007,36(1):49.

[5]Macias MY,Syring MB,Pizzi MA,et al.Pain with no gain:allodynia following neural stem cell transplantation in spinal cord injury[J].Exp Neurol,2006,201(2):335.

The Experimental Study of Glial Cell Line-derived Neurotrophic Factor Gene Transfection to Schwann Cells

DU Wen-yan,WANGJing-hong,LIU Qin-yi,et al.(The OrthopedicsDepartment of theFirst Hospitalof JiamusiUniversity,Jiamusi154002,China)

ObjectiveTo observe the expression of GDNF and the role of nutrition and protection in Schwann cells through GDNF gene's transfetion to Schwann cells.MethodsThe Schwann cells were divided into control group,empty vector group,vector group.The GDNF gene was transfected into Schwann cellsthrough cationic liposome mediattion.The nutritional function and expression effectwere examined thoughMTT,immunohistochemistry,flow cytometry at 24 h,48 h,72h after transfection of eachgroup.ResultsThe cells in vector group were more proliferated and vigorous than the other two groups in MTT;Immunohistochemistry showed high expression of GDNF in vector group;There were obvious nutritional role of transfectedGDNF gene on Schwann cells in flow cytometry.ConclusionAfter GDNF gene transfection to Schwann cells,there were high expression of GDNF gene which had obvious nourishing and protective effects on Schwann cells.

Schwann cells;Glial-derived neurotrophic factor;transfection

1007-4287(2010)01-0020-03

吉林省科技廳資助課題,課題編號為200705222

*通訊作者

2009-05-22)