大鼠正常腦組織伽瑪刀照射后MRI表現及GFAP表達的實驗研究

王 鵬,于金明,朱玉存,程勛全,楊渭川,葛 銳,王自勇,喬飛飛

(1.合肥仁濟腫瘤醫院伽瑪刀研究中心,安徽合肥 230022;2.山東省醫學科學院山東省腫瘤防治院放療科;3.安徽省立醫院放射治療科)

大鼠正常腦組織伽瑪刀照射后MRI表現及GFAP表達的實驗研究

王 鵬1,2*,于金明2,朱玉存1,程勛全3,楊渭川1,葛 銳1,王自勇1,喬飛飛1

(1.合肥仁濟腫瘤醫院伽瑪刀研究中心,安徽合肥 230022;2.山東省醫學科學院山東省腫瘤防治院放療科;3.安徽省立醫院放射治療科)

目的研究伽瑪刀(Gamma knife)照射大鼠尾狀核后膠原纖維酸性蛋白(GFAP)的表達隨時間的變化,探討星形膠質細胞的增殖與放射損傷的關系以及放射性損傷的影像學表現。方法40只成年雌性Wistar大鼠,10只大鼠作為對照組。30只大鼠接受MASEP-SRRS型伽瑪刀8 mm準直器以50 Gy(50%等劑量線)照射大鼠右側尾狀核。照射后的30只大鼠隨機分為3組,每組10只。不同組別的大鼠分別在照射后第1,4,12周深度麻醉下斷頭取出腦組織,行免疫組織化學染色觀察GFAP的表達,并使用梯度柱法測量腦組織的比重。大鼠處死前接受1.5 T MRI軸位平掃和增強掃描。結果MRI提示照射后第12周可發現受照大鼠尾狀核T2相可見受照區信號增高,增強T1相可見受照區強化明顯。對照組大鼠腦組織內均勻散在分布少數GFAP陽性細胞,輪廓清楚,星形突起纖細。照射后4周靶區內GFAP陽性細胞數目開始增多,細胞形態變得不規則。至12周時GFAP陽性細胞進一步增多,胞體變大,細胞突起粗大不規則,胞漿染色呈深棕色。照射后第4周和第12周檢測到照射側腦組織比重與對側相比顯著減輕。結論GFAP可作為衡量腦放射性損傷的指標。照射后早期即出現腦水腫反應和血腦屏障破壞。在不同時間點的病理變化可以通過MRI信號觀察不同時間點的病理變化。

膠質纖維酸性蛋白;中樞神經系統;放射損傷

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0023)

本研究旨在建立伽瑪刀放射性損傷的大鼠動物模型,探討正常腦組織受伽瑪刀照射后在不同時間點腦組織膠質細胞膠質纖維酸性蛋白(GFAP)及腦組織水含量變化,以及MRI影像學改變,現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及主要實驗儀器 成年健康雌性Wistar大鼠40只,體重300-400g?，斘髌?深圳)醫學科技有限公司生產MASEP-SRRS型伽瑪刀,焦點吸收劑量率 1.5 Gy/min,運用MASEP Superplan 2.0劑量計劃系統進行劑量計劃設計。影像定位采用Siemens 1.5 Tesla超導MRI。用自制高強度有機玻璃大鼠立體定向放射外科固定裝置與Leksell立體定向儀框架及適配器相配合?？贵w及免疫組化試劑盒購自北京中山公司。

1.2 實驗方法 將大鼠在10%水合氯醛(3 ml/Kg體重i.p)麻醉下固定于伽瑪刀立體動物定位頭架上,用Siemens 1.5 Tesla超導MRI行大鼠大腦橫軸薄層連續掃描,所得影像資料輸入計算機工作站,將治療靶點的位置確定于大鼠(n=30只)右側尾狀核,采用8 mm準直器對大鼠腦組織實施照射,等劑量曲線50%,周邊劑量50 Gy,中心劑量100 Gy。照射組(n=30只)行伽瑪刀照射,并隨機分為3組,每組10只,擬分別于第1周末,第4周末和第12周末處死。對照組(n=10只)未行伽瑪刀照射。伽瑪刀治療后大鼠常規飼養,避光、溫暖、給予充分的水和食物,觀察大鼠的活動、精神狀況、飲食以及體重等。大鼠在處死前使用1.5 T MRI觀察影像學變化(橫軸)。在第1、4、12周末的時間點分別將各組大鼠處死,在10%水合氯醛深度麻醉下,開胸經左心室升主動脈插管先以100 ml生理鹽水沖洗血液,隨后用冷的(4℃)含40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液液灌注固定,取出腦組織,標本于10%福爾馬林中固定24小時,免疫組化采用SP法,陰性對照用PBS代替一抗。

1.3 圖像分析 切片經圖像分析儀(Quantimet 570C,Leica)處理。GFAP陽性細胞面積測定選擇對照組大鼠及照射組大鼠的照射側和對照側尾狀核,在10(目鏡倍率)×20(物鏡倍率)倍率下,任選5個視野,計數GFAP陽性細胞數。

1.4 腦組織比重的測定 在大鼠雙側大腦半球尾狀核各取5-10 mg腦組織,以梯度柱法測定腦組織的比重。

2 結果

2.1 大鼠一般情況觀察 各組動物在觀察期間無一死亡,但攝食減少,活動稍減少,皮毛顯不潔,發黃,體重減輕。

2.2 大鼠照射后MRI變化 大鼠在第1、4、12周行頭顱MRI檢查,在第12周再次行MRI檢查可見T2WI可見受照靶區呈高信號,結構有破壞,增強TIWI可見受照靶區有強化。第1、4周末影像學未見有T2WI高信號,增強T1WI未見有強化。見圖1、2。

2.3 GFAP免疫組織化學染色觀察 正常對照組大鼠腦相當于靶組織內均勻散在分布少數的GFAP陽性細胞細胞輪廓清楚,星狀突起纖細,為星形細胞。GFAP分布于星形細胞胞漿及星狀突起中,為棕黃色顆粒。照射后4周靶區GFAP陽性細胞散在分布,輪廓清楚,星狀突起纖細,形態、數目較對側及對照組顯著增加。照射后12周右側尾殼核區域內GFAP陽性細胞數目較對側及假照射組顯著,可見神經元腫脹,增多,胞體變大,胞漿顏色較深。見圖3、4,表1、2。

2.4 腦組織比重的測定 大鼠正常大腦的腦比重為1.047,照射后1周的腦比重為1.044,照射后4周的腦比重為1.036,照射后12周的腦比重為1.035。伽瑪刀照射后第4周和第12周腦組織比重明顯低于正常對照組和照射前水平(P＜0.05)。對側腦組織比重的變化各組間無顯著差異。

圖1 第12周增強T1WI可見大鼠尾狀核強與對側形成對比

圖2 第12周T2WI可見大鼠 尾狀核呈高信號,高于對側尾狀核

圖3 照射后4周靶區GFAP 陽性細胞散在分布,輪廓清楚,星狀突起纖細形態、數目較對側及對照組顯著增加(10×20倍)

圖4 照射后12周右側尾殼核區域內GFAP陽性細胞數目較對側及假照射組顯著,可見神經元腫脹,增多,胞體變大,胞漿顏色較深(10×20倍)

表1 GFAP陽性細胞數組內比較(n=10)

表2 GFAP陽性細胞數組間比較(n=10,t檢驗)

3 討論

星形細胞是哺乳動物大腦內分布最廣且具有十分重要的功能,許多研究表明它與神經系統大多數疾病發生、發展有密切關系。作為細胞骨架主要成分的正常情況下,腦內GFAP少有表達,中樞神經系統受損時發生GFAP水平上調,是星形膠質細胞最常見的特征性反應,GFAP不但是星形細胞在細胞水平的特異性標記物,而且已成為病理情況下敏感的生化指標之一[1]。中樞神經系統的各種類型損傷均可引起星形細胞的反應,使星形細胞由常態轉化為反應性星形細胞,表現為細胞數目增加、細胞體肥大,星形膠質細胞分支增多,并且GFAP的表達增強。因此GFAP可以作為中樞神經系統損傷范圍及預后的生化標志物。

魏銘等[2]進行星形膠質細胞學伽瑪刀照射的離體研究,給予膠質瘤細胞4-36 Gy伽瑪刀照射后發現:原代培養膠質細胞經伽瑪刀照射后GFAP表達增高,呈劑量依賴性增高,即隨放射劑量的提高GFAP陽性細胞數增加更加明顯,并且作者認為與縫隙連接蛋白-43(Cx-43)的異常低表達有關。

本研究選擇大鼠右側尾殼核作為照射靶點,研究的時間點選擇照射后第1,4,12周,希望詳細地了解照射后3個月內GFAP的動態變化,而前3個月的期限恰好是放射外科治療并發癥出現前的潛伏期,參照文獻[3]的我們的實驗劑量采用50 Gy,揭示了CNS在接受50 Gy照射后在第1周后沒有顯著變化,第4周檢測時發現GFAP表達增多并且隨著時間的推移星形細胞不斷增多,細胞逐漸肥大,細胞突粗大不規則;照射12周后GFAP表達和細胞學形態改變進一步顯著增加。這和Kamiro和楊婷等的報道是一致的。Kamiro等[4]研究伽瑪刀照射大鼠腦組織后的組織學變化,他們運用4 mm準直器照射大鼠右側頂葉皮質,給與120Gy的劑量后一天即發現GFAP染色增強,星形細胞出現肥大,在第4周時最為明顯。在給予50 Gy劑量時,他們觀察了1,3,6,9,12個月這幾個時間點,發現在照射后一個月GFAP表達呈“±”,至三個月時呈陽性表達。楊婷等[5]同樣應用4 mm準直器照射大鼠尾殼核前部,90 d后取腦組織作免疫組化研究,研究不同放射劑量照射后GFAP的表達和星形細胞的變化,發現隨著放射劑量的增高反應性星形細胞的數量和GFAP的表達愈加升高。

本研究在伽瑪刀照射后不同時間點對大鼠進行了MRI影像學檢查。大鼠在照射后第12周行MRI檢查提示有影像變化,表現為:在T2WI上表現為尾狀核區不均勻高信號,T1WI相沒有顯著改變,增強T1WI上表現為尾狀核的增強,而在第1、4周末沒有提示有MRI影像學的顯著改變,我們推測腦組織接受電離輻射后血管內皮細胞破壞和死亡,造成血腦屏障導致血液中的增強劑量進入瘤體,并且伴隨有尾狀核細胞的死亡。星形膠質細胞是組成血腦屏障的一類細胞,它伸出的足樣投射幾乎完全包繞著血腦屏障的毛細血管,在維持血腦屏障功能方面起著重要作用[6]。王璐等[7]作了關于GFAP表達與血腦屏障的相關性研究,發現嚴重燙傷后GFAP表達增加、血腦屏障的通透性增高,該作者認為腦內GFAP對維持血腦屏障功能的完整性具有重要作用,其表達水平的增加可能標志著血腦屏障的破壞,故作者推測星形細胞的反應性增生與血腦屏障損害,繼發性腦水腫有關。大鼠尾狀核伽瑪刀照射后MRI掃描血腦屏障打開是否也存在類似機制還有待于進一步研究。

綜上所述,50Gy對大鼠尾狀核照射后,星形細胞增生肥大,GFAP陽性細胞增多且隨著照射后時間的延長而更加明顯,并且伴隨者大腦比重的降低,提示GFAP可作為伽瑪刀照射后放射性損傷的指標。大鼠大腦照射后組織破壞,血腦屏障打開,在1.5T MRI表現為T2WI高信號,增強T1WI有較明顯的強化。

[1]Gomes FC,Paulin D,Moura-Neta V.Glial fibrillary acidic protein(GFAP):modulation bygrowth factors and its implication in astrocyte differentiation[J].Braz J Med Biol Res,1999,32(5):619.

[2]魏 銘,徐德生,張建寧,等.伽瑪刀照射后膠質細胞Cx43和GFAP表達及意義[J].國際神經病學神經外科雜志,2009,36(1):1.

[3]Kamiryo T,Kassell NF,Thai QA,et al.Histological changes in the normal rat brain after gamma irradiation[J].Acts Neurochi(Wien),1996,138:451.

[4]Kamiryo T,Kassell NF,Thai QA,et al.Histological changes in the nor mal rat brain after gamma irradiation[J].Acts Neurochi(Wien),1996,138:451.

[5]楊 婷,饒志仁,吳聲伶,等.γ-刀不同劑量一次單側照射大鼠尾殼核后前腦星形膠質細胞的變化[J].中華放射醫學與防護雜志,1999,19:316.

[6]Janzer RC,Raff MC.Astrocytes induce blood-brain brarrier properties in endothelial cells[J].Nature,1987,325(6101):253.

[7]王 璐,王航輝,谷秀娟.嚴重燙傷后腦內GFAP表達變化與血腦屏障功能的關系[J].陜西醫學雜志,2009,38(1):34.

An experimental study on the expression of glial fibrillary acidic protein and MRI imaging changes in the normal Wistar rat brains after Gamma knife radiosurgery

WANGPeng,YU Jin-ming,ZHU Yu-cun,et al.(Department of Gamma Knife Center,Hefei Renji Cancer Hospital,Hefei230022,China)

ObjectiveTo explore the time-related expression of GFAP andMRI imaging changes in the normal rat brain during the subacute phase after Gamma knife irradiationy.Methods40 adult female Wistar rats were were enrolled into the study.Ten rats served as controlled group while the other thirty rats underwent Gamma knife.The right caudate-putamen nucleus was selected as the target of irradiation.A 8 mm collimator was used to transmit 50 Gy to the target region.Ratswere killed 1st,4thand 12ndweeks after gamma knife irradiation.GFAP were detected by avidin-biotin complex technique.And serial MRI imaging were obtarined at 1st,4thand 12ndweeks.And specific gravity of the brain were also obtained.ResultsThe number of GFAP positive cells(astrocytes)in the target region 1stweek after irradiation was not statistically different from that of the control group.GFAP positive cellsin the target region gradually increase in the 4thand12ndweeks after irradiation comparedwith the sham group.The shape of astrocytesbecame irregularly over time.The specific gravity decreased during the 4thand 12ndweek.High signalwere found on MRI scans by T2WI and enhanced T1WI serials.ConclusionActive astrocytosismay play an important role in the pathological changesin the normalbrain after Gamma knife radiosurgery.SerialMRI scan can observed the pathological changes by signal changes.

GFAP;Central nervous system;Radiation injury

R651.1;R814.42

A

1007-4287(2010)01-0023-04

衛生部課題(WKJ 2005-3-006)

*通訊作者

王鵬,男,博士,研究方向:腫瘤精確放射治療、神經系統疾病的放射外科治療以及正常組織的放射性損傷研究。

2009-04-07)