銀杏葉總黃酮提取工藝的正交設計研究

李寧,李楚

(1.山西醫科大學藥學院,山西 太原030001;2.山西省中醫藥研究所,山西 太原030001)

銀杏葉為銀杏科植物銀杏的葉片,主要化學成分為黃酮類、萜類,其中總黃酮含量最高[1～3]。天然來源的生物黃酮分子量小,能被人體迅速吸收,能通過血腦屏障,進入脂肪組織,進而體現消除疲勞、保護血管、防止動脈硬化、擴張毛細血管、疏通微循環、活化大腦及其他臟器的功能。試驗通過參考相關文獻[4～6],最終采用乙醇水溶液作為溶劑,通過正交設計方法,考察總黃酮在提取物中的含量,以確定銀杏葉的最佳乙醇回流提取工藝。

1 材料與儀器

銀杏葉采自太原兒童公園,蘆丁標準品(中國生物制品檢定所,批號:0080-9705),亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、正丁醇(無水)、乙醇(分析純)。

主要儀器:旋轉蒸發儀RE-52AA,電子天平,UV-760CRT雙光束分光光度計,恒溫水浴槽,電熱恒溫鼓風干燥箱。

2 實驗方法

2.1 試驗因素及方案

參考前人研究結果[7],確定影響總黃酮提取效率的考察因素有4個,分別為:溶劑濃度(A)、料液比(B)、提取次數(C)、提取時間(D),正交實驗考察因素見表1?？紤]各種影響因素,選擇了L9(34)的正交試驗方案[8]。

2.2 供試品溶液的制備

將采摘的銀杏葉片放入60～70℃的干燥箱中烘干24 h,粉碎后過40目篩,取15.6 g銀杏葉粉末置于提取容器內,加不同濃度乙醇適量回流提取,過濾。殘渣再加不同濃度乙醇適量回流提取,過濾。殘渣用醇液洗滌數次,轉移至250 mL容量瓶中,用乙醇定容。用UV-760CRT雙光束分光光度計在510 nm處進行測定[9～11],以60%乙醇作參比液,采用硝酸鋁比色法[12～14],測定總黃酮的含量。

表1 正交實驗考察因素Table 1 Levels oforthogonal experiment

總黃酮含量(%)=供試品吸光度×標準品相當蘆丁量/標準品吸光度×供試品量

2.3 對照溶液的制備

精密稱取蘆丁對照品20 mg,置于10 mL的容量瓶中,加入60%的乙醇溶液6 mL,微熱使其溶解,再用60%的乙醇定容至刻度,搖勻,得濃度為2 mg·mL-1的蘆丁標準貯備液[15～17]。

2.4 標準曲線的制備

精密吸取對照溶液 0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5 mL 分別置于編號 1、2、3、4、5、6號的 10 mL具塞刻度試管中,先加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL,搖勻,放置6 min,再加10%硝酸鋁溶液0.3 mL,搖勻,再放置5 min,加4%氫氧化鈉溶液4 mL,各加60%乙醇定容至10 mL,放置15～20 min,在波長510 nm處測定各試管中溶液的吸光度。以濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,得回歸方程:A=8.0643c+0.0339(r=0.9920,n=6)。在0.05～0.3 mg·mL-1范圍內,線性關系良好。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

2.5 精密度試驗

準確量取同一濃度的蘆丁標準品溶液0.2 mL,置于10 mL量瓶中,在 510 nm波長處連續6次,測定吸光度,測得精密度RSD=0.28%。

2.6 穩定性試驗

取同一濃度的供試品溶液,每隔4 h測定一次,結果 6次測定的吸收值基本不變,RSD=0.32%,表明供試品溶液至少在24 h內穩定。

2.7 加樣回收率試驗

準確量取2.2中的供試品溶液10 mL,分別取6份,準確加入蘆丁標準品1 mg,按供試品提取測定方法,計算回收率,得平均回收率=96.76%,RSD=1.09%(n=6)。

3 結果與分析

3.1 試驗結果分析

按照正交試驗方案對總黃酮提取條件進行了研究,結果見表2。

表2 正交試驗設計及試驗結果分析L9(34)Table 2 Orthogonal design and analysis of results L9(34)

由表2可看出,K1、K2、K3表示各個因素分別取3個水平時相應的試驗結果之和;k1、k2、k3為K1 、K2 、K3的算術平均值;極差 R是k1、k2、k3中最大值與最小值之差,它反映了試驗中各因素影響的大小。它們的大小順序反映出相關因素分別取三個水平時提取率的高低。

3.2 試驗因子影響的比較分析

為了比較正交實驗中4個實驗因素對實驗結果的影響,確定哪些或哪個參考因素對實驗提取結果的影響是最顯著的或比較顯著的,從而尋找出最佳實驗操作條件,進行了方差分析,結果見表3。

表3 正交試驗方差分析Table 3 Variance analysis oforthogonal experiment

由表3方差分析可知,各因素影響的順序為:A＞C＞B＞D,即乙醇的濃度對提取率的影響最大,提取時間影響最小。A2B2C2D1的組合最佳,即稱取15.6 g銀杏葉粉末加60%乙醇,料液比為1∶8,提取2次,每次1h為提取的最佳條件。

3.3 試驗結果的穩定性驗證

將采摘的銀杏葉片放入60～70℃的干燥箱中24 h,粉碎后過40目篩,置于提取容器內,按已確定的最佳提取工藝,過濾,重復一次。殘渣用醇液洗滌數次,轉移至250 mL容量瓶中,乙醇定容。重復試驗3次,數據見表4。

表4 銀杏葉總黃酮最佳提取工藝的驗證Table 4 Best extraction technique of FG

表4結果表明:驗證試驗結果與正交試驗結果相近,確定該提取工藝基本穩定、可行。

4 討論

以銀杏葉總黃酮提取液在510 nm波長處的吸光度為參考指標,通過總黃酮提取工藝的正交試驗研究,確定了從銀杏葉中提取總黃酮的最佳條件為:以60%乙醇為溶劑,料液比為1∶8,提取2次,每次1 h,提取處理銀杏葉15.6 g。通過穩定性實驗,確定總黃酮至少在24 h內是穩定的。該提取方法操作簡便,結果準確可靠。為進一步研究銀杏葉中總黃酮提取工藝提供理論依據。銀杏葉含有豐富的黃酮[18～20],具有廣泛開發和利用價值,值得綜合利用,應該加強其資源開發。

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