RT-LAMP技術檢測菜豆莢斑駁病毒的研究

聞偉剛, 楊翠云, 崔俊霞, 張 穎

(1.寧波出入境檢驗檢疫局,寧波 315012; 2.上海出入境檢驗檢疫局,上海 200135)

菜豆莢斑駁病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)是我國對外公布的檢疫性有害生物,該病毒可通過種子傳播,引起大豆產量的下降并降低大豆品質[1]。因此,加強對該病毒的檢測具有重要的意義。

目前,針對 BPMV的檢測方法主要有 DASELISA和RT-PCR技術[2-4]。相比傳統的電鏡觀察和生物學鑒定,這2種方法在檢測周期方面具有明顯的優勢,操作也更為簡單。隨著實時熒光 RTPCR技術的發展[5-7],因其具有高特異和高靈敏的優點,針對BPMV的實時熒光RT-PCR檢測也有了詳細的研究[8]。

環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)作為一種新穎的核酸擴增方法,同樣具有檢測速度快、操作簡單和靈敏度高等優點。該技術依賴于能夠識別靶序列上6個特異區域的引物和一種具解旋功能且呈瀑布式擴增的Bst DNA聚合酶,在等溫條件下可高效、快速和特異地擴增靶序列[9]。由于LAMP呈瀑布式擴增,因此其擴增效率非常高;同時,LAMP識別靶序列上的6～8個特異性位點,其特異性也很強;LAMP只在60～65℃進行恒溫擴增,只要水浴鍋即可,無需特殊的儀器,操作非常簡單;而且 LAMP的整個檢測反應只需1.5～2.5 h,檢測周期非常短?；贚AMP技術所具有的優點,本文針對菜豆莢斑駁病毒的RT-LAMP檢測方法的建立進行了研究。

1 材料與方法

1.1 供試材料

菜豆莢斑駁病毒的陽性標準物質購自美國Agdia公司,樣品狀態為新鮮葉片經液氮處理,磨成粉末狀,冷藏于4℃冰箱保存。含有BPMV的陽性樣品為從美國進口的大豆種子,經普通 RT-PCR與DAS-ELISA檢測確證含有BPMV[4]。南方菜豆花葉病毒(Southern bean mosaic virus,SBMV)、南芥菜花葉病毒(Arabis mosaic virus,ArMV)、大豆花葉病毒(Soybean mosaic virus,SMV)、煙草環斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)以及番茄環斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)等陽性標準物質也都購自美國Agdia公司。

RT-LAMP引物由上海英駿生物技術公司合成。核酸提取試劑Trizol購自上海生物工程公司。RT-ULAMP擴增試劑盒購自北京美萊博醫學科技有限公司。One-step RNA PCR kit與 DL-2000 Marker購自大連TaKaRa公司。

1.2 引物設計

引物序列見表1。根據GenBank(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)中已登錄的菜豆莢斑駁病毒的外殼蛋白基因序列(M62738),采用Blast程序進行同源性比較,在序列的保守區,使用Primer Express 3.0軟件 ,設計得到 F3 、B3、FIP(F1c+TTTT+F2)、BIP(B1c+TTTT+B2)、Loop1和 Loop2共 6條引物,分別識別外殼蛋白編碼基因的8個位點。

表1 RT-LAMP檢測菜豆莢斑駁病毒的引物

1.3 菜豆莢斑駁病毒的RT-LAMP擴增

1.3.1 總RNA提取

采用Trizol試劑方法提取[4]。

1.3.2 RT-LAMP擴增

反應體系:2×U-LAMP Mix 10μL,引物F3和B3的終濃度各為0.2μmol/L,Loop1和Loop2的終濃度各為0.8μmol/L,FIP和BIP的終濃度各為1.6μmol/L,Bst DNA 聚合酶(5 U/μL)1.5μL,AMV RNA 聚合酶(5 U/μL)1 μL,模板 RNA 1μL,用dd H 2O補充至總體積20μL。

反應條件如下:在恒溫60℃的水浴鍋中擴增1 h。

1.3.3 RT-LAMP結果分析

反應結束后,取10μL擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,在GelDoc-2000(Bio-Rad)凝膠成像系統上觀察并記錄結果。

1.4 RT-LAMP的特異性試驗

抽提得到南方菜豆花葉病毒、南芥菜花葉病毒、大豆花葉病毒、煙草環斑病毒以及番茄環斑病毒等幾種侵染大豆的植物病毒RNA,按照建立的菜豆莢斑駁病毒RT-LAMP檢測方法,進行特異性研究。健康大豆種子提取液作為陰性對照。

1.5 菜豆莢斑駁病毒RT-PCR檢測方法的建立

RT-PCR反應體系參照One-step RNA PCR kit試劑盒說明進行,其中引物為F3和B3。反應條件如下:50℃cDNA合成30 min,94℃預變性2 min;94℃變性30 s,60℃復性 30 s,72℃延伸1 min,35個循環;最后72℃延伸 5 min。

1.6 RT-LAMP的檢測靈敏度試驗

將提取好的菜豆莢斑駁病毒RNA模板進行10倍系列稀釋 ,得到 10-1、10-2、10-3、10-4和 10-5稀釋的病毒 RNA樣品。采用建立的 RT-LAMP和RT-PCR方法進行擴增靈敏度比對試驗。

1.7 進境樣品中BPMV的RT-LAMP檢測

選取20份從美國進境的大豆樣品,通過樣品處理得到總RNA[4],采用建立的RT-LAMP方法進行檢測。

2 結果與分析

2.1 菜豆莢斑駁病毒的RT-LAMP擴增結果

菜豆莢斑駁病毒的陽性標準物質和含有BPMV的陽性美國大豆樣品RNA經過RT-LAMP擴增后,均能夠得到特異性的瀑布狀條帶,而其他病毒毒株的RNA模板則無擴增條帶出現,也未從健康大豆種子提取液的RNA模板中擴增到特異性基因條帶(圖1)。這表明本研究設計的6條引物針對BPMV的檢測具有非常好的保守性與特異性。

2.2 RT-LAMP檢測靈敏度試驗

不同稀釋梯度的菜豆莢斑駁病毒RNA經過RT-LAMP擴增后,其檢測靈敏度為10-3病毒稀釋液(圖2a),比普通RT-PCR方法的檢測靈敏度高出1 000倍(圖2b)。

圖1 RT-LAMP擴增菜豆莢斑駁病毒

圖2 RT-LAMP和RT-PCR檢測菜豆莢斑駁病毒的靈敏度

2.3 大豆樣品的RT-LAMP檢測

針對20份從美國進境的大豆樣品,預先采用DAS-ELISA方法進行檢測,結果判定為BPMV陽性。然后采用本研究建立的 RT-LAMP方法進行檢測,均可獲得陽性結果。

3 討論

自環介導等溫擴增技術建立以來,該方法已被逐漸應用于細菌、病毒和寄生蟲等的檢測。2004年,Fukuta等用免疫捕獲RT-LAMP方法檢測感染菊花的番茄點狀枯萎病毒,結果顯示,免疫捕獲RTLAMP的敏感性比RT-PCR高出100倍[10]。Hong等用LAMP方法檢測嚴重急性呼吸綜合征(SARS)病毒,與傳統 RT-PCR方法相比,靈敏度高出100倍,可在1 h內獲得結果,最短為11 min[11]。秦智鋒等建立口蹄疫病毒的RT-LAMP檢測方法,從核酸抽提到檢測僅需75 min,并采用加入熒光染料SYBR green I直接進行肉眼或紫外照射觀察陽性結果[12]。

本研究建立的菜豆莢斑駁病毒RT-LAMP檢測方法,針對RNA的稀釋液進行靈敏度研究表明,該方法的檢測靈敏度比RT-PCR高1 000倍,從核酸抽提到結果觀察的整個檢測周期約2～2.5 h,因此,具有靈敏、快速和特異性高的優點。但同時,該方法也存在不足的地方,首先是引物的設計,針對8個基因位點共設計6條引物,缺乏專門的RTLAMP引物設計軟件,只能采用普通PCR引物設計軟件,其引物設計和評估的難度比較大;另外,FIP和BIP引物因堿基數多且使用量大,檢測成本較高。其次,在本研究過程中,曾采用熒光染料 SYBR green I進行RT-LAMP擴增產物的觀察,雖然陽性結果在紫外照射下能夠顯示白色發光,但陰性和空白對照同樣有白色發光,這使得在現場很難判定陽性結果,而只能用電泳方法進行判斷。SYBR green I染料的工作原理是只要擴增產物中出現雙鏈DNA,就會嵌入當中而發出熒光,RT-LAMP共使用了6條引物約200個堿基,在實際擴增中往往會出現一定程度的自環化現象,從而導致陰性和空白對照也出現熒光反應。最后,RT-LAMP的瀑布狀擴增產物與傳統的PCR特異性條帶存在差異,這會使得研究人員在結果判定方面不適應。

RT-LAMP方法不需要特殊的試劑和儀器設備,隨著該技術的不斷完善與改進,將會建立起一種成本低廉的檢測體系,從而在病原檢測和疾病快速診斷等領域具有廣泛的應用前景。

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