葛根素對異丙腎上腺素誘導的心肌纖維化大鼠左室收縮功能的影響*

劉詩英,王夢洪,吳曉牧,危春英,彭小平,左漢恒

(1.江西省人民醫院神經內科,南昌 330006;2.南昌大學第一附屬醫院心內科 330006;3.濟寧醫學院附屬醫院心內重癥監護室,山東 272029)

葛根素對異丙腎上腺素誘導的心肌纖維化大鼠左室收縮功能的影響*

劉詩英1,王夢洪2,吳曉牧1,危春英2,彭小平2,左漢恒3

(1.江西省人民醫院神經內科,南昌 330006;2.南昌大學第一附屬醫院心內科 330006;3.濟寧醫學院附屬醫院心內重癥監護室,山東 272029)

目的研究葛根素對異丙腎上腺素(ISO)誘導的心肌纖維化大鼠左室收縮功能的影響及其作用機制。方法采用ISO(5 mg·kg-1·d-1×10 d)皮下注射誘導大鼠心肌纖維化,給予葛根素(100 mg·kg-1·d-1)干預,實驗共進行8周。將 32只雄性SD大鼠隨機分成4組:模型組8只,空白對照組8只,葛根素早期干預組8只,葛根素后期干預組8只。于實驗末,予超聲心動圖檢測大鼠左室射血分數(LVEF)及縮短分數(FS),計算左心室質量指數,取左室心肌組織進行VG染色、免疫組織化學染色,分別測算膠原容積積分(CVF)、心肌組織中轉化生長因子β1(TGF-β1)和結締組織生長因子(CTGF)表達量,取左室游離壁心肌組織檢測羥脯氨酸濃度,并運用RT-PCR半定量分析CTGF mRNA和TGF-β1mRNA水平。結果與模型組比較,葛根素明顯改善大鼠左室收縮功能(P＜0.01),降低左心室質量指數、CVF及羥脯氨酸濃度(P＜0.01),以及抑制CTGF和 TGF-β1的過度表達(P＜0.01)。相關分析顯示4組大鼠的左室心肌組織CTGF蛋白與CVF和羥脯氨酸濃度呈正相關(P＜0.05)。結論葛根素能明顯改善左心室收縮功能,這種作用機制可能是通過抑制左室心肌組織中TGF-β1和CTGF的過度表達來實現。

葛根素;轉化生長因子β1;胞間信號肽類和蛋白;心肌纖維化

Liu Shiying1,Wang Menghong2,Wu Xiaomu1,Wei Chunying2,Peng Xiaoping2,Zuo Hanheng3

(1.Department of Neurology,the People′s Hospital of Jiangxi Province,Nanchang 330006,China;

2.Departmentof Cardiovascular,the First Af filiated Hospital of Nanchang University,Jiangxi 330006,China;

3.Cardiac Intensive Care Unit,A f filiated Hospital of J ining Medical College,Jining,Shangdong 272029,China)

隨著社會人口的老齡化,心血管疾病已成為引起人類4大死亡原因之首,嚴重威脅著我國人民的健康。多種心血管疾病如高血壓、心臟病、心肌梗死、慢性充血性心力衰竭、心房纖顫、心肌炎等,都伴有心肌重構的病理過程,而心肌纖維化(myocardial fibrosis,MF)是心肌重構的重要環節,有重要的臨床意義,故成為熱點研究內容[1]。本文探討中成藥注射用葛根素對異丙腎上腺素(isoprenaline,ISO)誘導的大鼠左室收縮功能、左室心肌組織中轉化生長因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)和結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)表達的影響,對闡述葛根素和MF的關系有一定理論意義和潛在的臨床應用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組 32只SD雄性大鼠[南昌大學動物科學部,SYXK(贛)2006-0001]體質量150～170 g,適應性喂養1周后開始實驗,將SD雄性大鼠按隨機數字表進行完全隨機設計分組,分為4組:模型組 8只,予ISO(上海禾豐制藥有限公司)5 mg·kg-1·d-1皮下注射 10 d建立大鼠 MF模型,同時給予生理鹽水1 mL腹腔注射8周[2-3];葛根素早期干預組8只,造模同時給予葛根素(山東瑞陽制藥有限公司惠贈)100 mg·kg-1·d-1,用生理鹽水稀釋至1 mL腹腔注射8周[3];葛根素后期干預組8只,造模同時給予生理鹽水1 mL腹腔注射10 d,然后給予葛根素100 mg·kg-1·d-1,用生理鹽水稀釋至1 mL腹腔注射46d;空白對照組8只,予以等量生理鹽水(10 mL·kg-1·d-1)皮下注射10 d,同時給予生理鹽水1 mL腹腔注射8周。

1.2 超聲心動圖檢查 所有SD大鼠于處死前1 d行超聲心動圖檢查,脫毛,稱體質量后,用3%戊巴比妥鈉麻醉(40 mg/kg,腹腔注射)。固定于木板上,連接心電圖肢體導聯,采用GE vivid 7彩色多普勒超聲診斷儀,選用探頭頻率12 MHz,寬頻線陣,深度2.5 cm。取胸骨旁左室長軸切面,啟動M型超聲心動圖,共測量5個心動周期,取平均值,整個實驗測量由專人負責[4]。測量指標:縮短分數(fractional shortening,FS)、左室射血分數(left ventricle ejection fraction,LVEF)等[4]。

1.3 左心室質量指數、心肌羥脯氨酸濃度檢測 SD大鼠麻醉后分離出左室并稱質量,計算左心室質量指數[左室質量/體質量(mg/g)]。左室游離壁心肌組織稱質量、勻漿后,按羥脯氨酸試劑盒說明書(堿水解法)操作(南京建成生物工程研究所)。

1.4 VG染色、CTGF和TGF-β1免疫組織化學染色 于實驗末(第56天)禁食、禁水12 h后稱大鼠體質量,麻醉后取離心尖5 mm的左室中段橫截面心肌標本,用4%多聚甲醛固定48 h后石蠟包埋,取近心尖的左室橫斷面進行連續切片18張,分別進行VG膠原染色和CTGF、TGF-β1免疫組織化學染色。將第1、4、7、10、13、16張切片進行常規脫蠟至水,按 VG 染色試劑盒說明書操作(福州邁新),光鏡下觀察膠原呈紅色。取第2、5、8、11、14、17張切片和第 3、6、9、12、15、18 張切片分別進行抗 CTGF 和抗TGF-β1的免疫組織化學染色:常規脫水,先分別以微波和煮沸修復抗原,再按SP檢測試劑盒說明書操作(美國Zymed公司),依次滴加山羊抗大鼠CTGF多克隆抗體和兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體(均為Santa Cruz公司產品)、二抗、試劑C、DAB顯色、蘇木素復染,同時以PBS替代一抗作為陰性對照。鏡下觀察CTGF和 TGF-β1染色陽性呈棕黃色。

1.5 膠原容積積分(CVF)測定及CTGF和 TGF-β1蛋白表達量分析 每張切片應用計算機圖像分析系統(HMIAS-2000W高清晰度彩色醫學圖文分析管理系統)隨機取10個高倍視野(×400),VG染色切片選紅色區域(膠原),CTGF和TGF-β1免疫組織化學染色切片則選棕黃色陽性染色區域,測算出每張切片選擇區域的面積百分比,以每個樣本的6張切片(VG染色切片或者CTGF和TGF-β1免疫組織化學染色切片)選擇區域面積百分比的平均值分別代表該樣本CVF或者CTGF和TGF-β1蛋白表達量。

1.6 RT-PCR檢測 將左室游離壁心肌組織約70 mg冰上勻漿后,按 TRIzol說明書提取總 RNA,取約 2 μ g總 RNA按照RT-PCR試劑盒(Fermentas公司)說明書進行 RT-PCR檢測。CTGF 引物:上游 5′-AAA GCA GCG ATATGC CTA CT-3′,下游 5′-ATC CAT TGC TTT ACC GTC TAC-3′,擴增片段長度為510 bp[3];TGF-β1引物:上游 5′-AGG CGG TGC TCG CTT TGT AC-3′,下游 5′-ATT CCG TCT CCT TGG TTC AGC-3′,擴增片段長度為 398 bp;β-actin 引 物:上游 5′-TGA CGT TGA CAT CCG TAA AGA C-3′,下游 5′-GGT GCT AGG AGC CAG GGC AG-3′,擴增片段長度為118 bp(引物由Generay Biotech公司合成)[3]。CTGF的PCR條件:94℃預變性3 min,94℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸1 min,30個循環,72℃延伸5 min。TGF-β1的PCR條件:94℃預變性3 min,94℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸1 min,28個循環,72℃延伸5 min。β-actin的PCR條件:94℃預變性3 min,94℃變性30 s,54℃退火30 s,72℃延伸1 min,25個循環,72℃延伸5 min。取 PCR產物 5 μ L在2%瓊脂糖凝膠上電泳,結果經凝膠掃描圖像處理系統分析CTGF mRNA和TGF-β1mRNA的相對表達量。

1.7 統計學處理 采用SPSS11.5統計軟件,所有計量資料以±s表示,所有數據進行正態性和方差齊性檢驗。FS、左心室質量指數、CVF、左室心肌組織羥脯氨酸濃度、CTGF mRNA、TGF-β1mRNA、CTGF 蛋白和 TGF-β1蛋白進行 one-way ANOVA和 Turkey HSD檢驗;LVEF方差不齊,則采用Kruskal-Wallis H檢驗,組間兩兩比較采用Games-Howell檢驗。組內CTGF mRNA、CTGF蛋白與 CVF、左室心肌組織羥脯氨酸濃度之間進行直線相關分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠 LVEF和 FS檢查結果比較 模型組大鼠LVEF和FS較空白對照組明顯降低(P＜0.01),見表1;葛根素干預組大鼠LVEF和FS與模型組比較均有明顯提高(P＜0.01),其中以葛根素早期干預組大鼠 LVEF和FS提高幅度更大(P＜0.05、P＜0.01)。

表1 4組SD大鼠 LVEF、FS檢查結果比較( ±s,%,n=8)

a:P＜0.01,與空白對照組比較;b:P＜0.01,與模型組比較;d:P＜0.05,c:P＜0.01,與葛根素后期干預組比較。

組別 LVEF FS模型組 74.0±4.3a 37.9±4.2a葛根素后期干預組 84.7±5.5b 49.5±5.6b葛根素早期干預組 91.1±2.3bd 57.3±3.0bc空白對照組 94.5±1.3 65.0±5.5

表2 4組SD大鼠左心室質量指數、CVF、左室心肌羥脯氨酸濃度比較( ±s,n=8)

表2 4組SD大鼠左心室質量指數、CVF、左室心肌羥脯氨酸濃度比較( ±s,n=8)

a:P＜0.01,與空白對照組比較;b:P＜0.01,與模型組比較;c:P＜0.01,d:P＜0.05,與葛根素后期干預組比較。

組別 左心室質量指數(mg/g) CVF(%) 羥脯氨酸濃度(μ g/mg)模型組 2.62±0.07a 18.74±1.52a 0.58±0.04a葛根素后期干預組 2.49±0.11b 16.74±1.58b 0.53±0.03b葛根素早期干預組 2.38±0.08bd 12.86±0.97bc0.49±0.03bd空白對照組 2.03±0.11 2.40±0.62 0.32±0.03

2.2 各組大鼠左心室質量指數、CVF和左室心肌羥脯氨酸濃度比較 與空白對照組比較,模型組大鼠左心室質量指數、左室心肌羥脯氨酸濃度和CVF均明顯增高(P＜0.01);葛根素干預組大鼠左心室質量指數、左室心肌羥脯氨酸濃度和CVF與模型組比較均明顯降低(P＜0.01);以葛根素早期干預組大鼠降低幅度更明顯(P＜0.05、P＜0.01),見表 2?？瞻讓φ战M大鼠心肌細胞,除血管周圍外,間質幾乎無膠原沉積。模型組大鼠心肌細胞間質可見大量膠原沉積和成纖維細胞增殖,膠原成柵欄樣包裹于心肌纖維周圍。葛根素干預組心肌細胞間質膠原沉積和成纖維細胞增殖較模型組少,見圖1。

表 3 4組SD大鼠左室心肌組織CTGF蛋白、TGF-β1蛋白、CTGF mRNA和TGF-β1 mRNA水平比較( ±s,%,n=8)

表 3 4組SD大鼠左室心肌組織CTGF蛋白、TGF-β1蛋白、CTGF mRNA和TGF-β1 mRNA水平比較( ±s,%,n=8)

a:P＜0.01,與空白對照組比較;b:P＜0.01,c:P＜0.05,與模型組比較;d:P＜0.01,e:P＜0.05,與葛根素后期干預組比較。

組別 CTGF蛋白 TGF-β1蛋白 CTGF mRNA TGF-β1mRNA模型組 33.7±2.9a 24.45±2.3a 107.2±11.1a 97.2±9.4a葛根素后期干預組 27.5±2.6b 21.79±2.2c 84.9±11.4b 88.1±7.9c葛根素早期干預組 24.2±2.5be 18.04±2.1bd 71.8±7.4be 73.2±7.0bd空白對照組 4.6±1.5 8.18±1.3 36.8±7.3 42.2±4.5

圖1 4組SD大鼠左室心肌組織VG染色(×200)

圖2 4組SD大鼠左室心肌組織CTGF免疫組織化學染色(×200)

2.3 各組大鼠左室心肌組織中CTGF蛋白和TGF-β1蛋白表達量比較 與空白對照組比較,模型組大鼠左室心肌組織中CTGF和 TGF-β1含量增加(P＜0.01);葛根素干預組大鼠左室心肌組織中CTGF和TGF-β1含量較模型組減少(P＜0.05);以葛根素早期干預組減少更明顯(P＜0.05),見表 3?？瞻讓φ战M大鼠心肌僅有極少量CTGF和TGF-β1表達,葛根素干預組和模型組大鼠心肌細胞的胞漿中CTGF和TGF-β1均有不同程度過度表達,以模型組最豐富,葛根素后期干預組次之,見圖2、3。

2.4 各組大鼠左室心肌組織中CTGF mRNA和TGF-β1mRNA表達量比較 RT-PCR擴增的CTGF mRNA和TGF-β1mRNA基因條帶經凝膠成像掃描系統成像分析結果見圖4。與空白對照組比較,模型組大鼠左室心肌組織中CTGF mRNA和 TGF-β1mRNA水平顯著上調(P＜0.01);與模型組比較,葛根素干預組大鼠左室心肌組織中CTGF mRNA和TGF-β1mRNA表達明顯受到抑制(P＜0.01、P＜0.05);以葛根素早期干預組受抑更明顯(P＜0.05、P＜0.01),見表3。

圖3 4組SD大鼠左室心肌組織 TGF-β1免疫組織化學染色(×200)

圖4 4組SD大鼠左室心肌組織CTGF mRNA和TGF-β1 mRNA 表達

2.5 相關性分析 4組大鼠左室心肌組織CTGF蛋白含量與CVF和左室心肌羥脯氨酸濃度呈正相關(P＜0.05);而左室心肌組織中CTGF mRNA水平與CVF、左室心肌羥脯氨酸濃度均無明顯相關性(P＞0.05)。

3 討 論

CTGF是一種近年來新發現的促成纖維細胞分裂和膠原沉積的細胞因子,近年來研究提示CTGF是心肌纖維化的重要生物學標記和未來減輕心肌纖維化的重要靶點[5-7]。CTGF啟動子包含 TGF-β1的一個反應元件,提示 CTGF是 TGF-β1的下游效應因子,在心臟成纖維細胞和心肌細胞中,TGF-β1誘導其表達CTGF[8-9]。本實驗中模型組大鼠左室心肌組織中TGF-β1蛋白和 TGF-β1mRNA表達明顯增加,分別為空白對照組的3倍和2倍,與 Pauschinger等[10]、Dean等[11]在纖維化心肌組織中觀察到的病理結果相似;并且本實驗模型組大鼠左室心肌組織中CTGF蛋白和CTGF mRNA水平也明顯增加,分別為空白對照組的 7倍和 3倍,比 TGF-β1增幅更顯著,與Dean等[11]在大鼠心肌梗死后期的心肌纖維化時期觀測的結果相似:CTGF增高的幅度顯著高于TGF-β1。本實驗的各組大鼠左室心肌組織中CTGF蛋白表達與心肌纖維化程度(CVF和左室心肌羥脯氨酸濃度)呈顯著正相關,但本實驗中各組大鼠左室心肌組織CTGF mRNA水平與心肌纖維化程度無明顯相關性,可能與本實驗觀測的時間點有關,具體原因還需要深入研究加以證實。

葛根素是由葛根分離出的一種異黃酮類化合物,在心血管領域應用廣泛,近年研究發現葛根素可減少心肌組織[3]、腎臟[12]、肝臟[13]等組織的膠原沉積。本實驗應用葛根素干預ISO誘導大鼠心肌組織的膠原沉積,觀察到葛根素能減少心肌間質膠原的沉積,降低左室心肌羥脯氨酸濃度,降低大鼠的左心室質量指數,表明葛根素具有減輕心肌纖維化的作用,從而改善心臟收縮功能,提高LVEF和FS。葛根素減輕心肌纖維化、改善心臟收縮功能的作用可能與抑制左室心肌組織TGF-β1、GTGF mRNA和蛋白的過度表達有關。本實驗結果顯示,與葛根素后期干預組比較,葛根素早期干預組大鼠LVEF和FS明顯提高,左心室質量指數、CVF、左室心肌羥脯氨酸濃度明顯降低,同時左室心肌組織CTGF mRNA和蛋白表達明顯減少,以及 TGF-β1mRNA和蛋白表達顯著減少,提示造模同時給予葛根素干預的效果比造模后給予葛根素干預的效果更好,這可能由于葛根素在造模期間就發揮了腎上腺素能阻滯效應[14],部分拮抗ISO激動腎上腺素能受體作用,以及造模期間葛根素即抑制CTGF和TGF-β1的表達,從而影響了心肌纖維化的發生、發展?；诒緦嶒灲Y果,得出葛根素有減輕和延緩ISO誘導大鼠的心肌纖維化,以及改善左室收縮功能的作用,這種作用機制可能通過抑制CTGF和TGF-β1的過度表達來實現。此外,在ISO誘導的慢性心肌纖維化大鼠模型中,葛根素減少心肌膠原沉積、減輕心肌纖維化和改善左室收縮功能的機制,是否與葛根素降低循環中AngⅡ[15],或是降低基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)和升高基質金屬蛋白酶組織抑制劑-2(TIM P-2)等作用有關尚需進一步深入研究[12]。

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Effect of puerarin on the left ventricle systolic function of the rats induced by isoprenaline*

ObjectiveTo investigate the effect of puerarin on the left ventricle systolic function,the expression of transforming growth factor β1(TGF-β1)and connective tissue growth factor(CTGF)in myocardial tissue of the rats induced by isoprenaline(ISO).MethodsIn this study,rat model of chronic myocardial fibrosis was established by subcutaneous injection with ISO(0.05%ISO,5 mg·kg-1·d-1×10 d).Meanwhile,rats were administrated by intraperitoneal injection with peurarin(100 mg·kg-1· d-1)for 46 days or 56 days respectively.Thirty-two male Sprague-Dawley rats were divided into four groups randomly:model group(n=8),control group(n=8),early treatment with puerarin group(n=8),later treatment with puerarin group(n=8).Until day 56,left ventricle function of the rats was detected by GE vivid 7 diasonography,left ventricle(LV)weight to body weight ratio was assessed.The cross serial transverse sections of LV of the rats were examined microscopically after van gieson(VG)collagen staining,CTGF-antibody immunohistochemistry(IHC)staining and TGF-β1-antibody IHC staining.The quantitative analyses of collagen volume fraction(CVF),CTGF protein and TGF-β1protein were performed using an image analysis computer system.CTGF mRNA level,TGF-β1mRNA level and ratio of hydroxyproline to the total protein in LV myocardial tissue were measured.ResultsComparing with model group,puerarin increased the LVEF and FS of the rats significantly(P＜0.01).However,when compared with model group,LV weight to body weight ratio and the ratio of hydroxyproline to the total protein in LV myocardial tissue of the early treatment with puerarin groups were decreased(P＜0.01).Comparing with model group,the CTGF protein and the TGF-β1protein in LV myocardial tissue of the early treatment with puerarin groups were markedly decreased(P＜0.01).CTGF protein was correlated with the ratio of hydroxyproline to the total protein and CVF in LV of rats of every group(P＜0.05).ConclusionThese data demonstrated that peurarin improved LV systolic dysfunction of the rats with chronic myocardial fibrosis induced by ISO.One of the mechanisms of the effects is related to downregulate the overexpression of CTGF and TGF-β1,in LV myocardial tissue.

puerarin;transforming growth factor β1;intercellular signaling peptides and proteins;myocardial fibrosis

10.3969/j.issn.1671-8348.2011.04.002

A

1671-8348(2011)04-0315-04

2009年江西省衛生廳課題資助項目(20093001)。

2010-04-18

2010-08-29)

·論 著·