靈芝孢子粉對PTZ致癇大鼠神經細胞野生型p53表達的影響①

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(1.右江民族醫學院病理生理學教研室,廣西 百色 533000 E-mail：zhsh8000@163.com;2.廣西醫科大學解剖學教研室,廣西 南寧 530021;3.佳木斯大學基礎醫學院病理生理學教研室,黑龍江 佳木斯 154007)

癲癇(Epilepsy,EP)是一種神經元發作性異常放電引起的、以反復癇樣發作為特征的臨床癥候群,為臨床常見慢性腦部疾患。癲癇發作可導致通過細胞凋亡實現的神經細胞損傷,雖出現較晚,卻能持續存在,進而可以參與海馬硬化等過程[1]。而野生型p53基因(wtp53)是誘導細胞凋亡的基因之一,因此,探討wtp53基因表達變化與癲癇發病的關系及其調控機制,成為了當前癲癇發病機制研究中的課題之一。

靈芝屬珍貴的藥用真菌,其生殖細胞——靈芝孢子(粉)(ganoderma lucidum spore powder)作為靈芝的重要藥用部位逐漸為人們所認識,靈芝孢子粉是靈芝發育后期彈射釋放出的種子,生物學上稱擔孢子,集中起來呈粉末狀。靈芝孢子粉含有豐富的天然抗氧化成分、氨基酸和各種微量元素,具有免疫調節、清除自由基、提高機體攜氧能力和耐受缺氧能力等作用,可提供大腦所需能量且對神經系統具有鎮靜和保護功能[2]。然而其對癲癇防治作用尤其是對神經細胞的保護作用研究鮮有報道。本研究旨在觀察靈芝孢子粉對戊四氮(PTZ)點燃大鼠wtp53免疫反應性的影響,進一步探討靈芝孢子粉對癲癇神經細胞凋亡抑制作用可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 健康雄性成年SD大鼠60只,10周齡,體重(200±20)g,由廣西醫科大學實驗動物中心提供(動物合格證編號：SCXK桂2009-0002),動物于實驗前1周置于實驗室適應環境,按照自然晝夜、普通環境飼養,室溫(25±1)℃,自由飲食。實驗動物隨機分為空白對照組,癲癇模型組,靈芝孢子粉用藥A、B、C即高、中、低劑量 3組(分別灌胃給予靈芝孢子粉150mg/kg、300mg/kg及450mg/kg),共分為5個小組,每組12只。

1.2 藥品試劑及儀器 PTZ購自美國Sigma公司;靈芝孢子粉取自泰山靈芝孢子為棕色粉末狀物質;wtp53多克隆抗體、sABC法免疫組化檢測試劑盒、DAB試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 癲癇模型的復制 PTZ用前以生理鹽水配制成溶液(10g/L),靈芝孢子粉用藥各組和癲癇模型組用PTZ亞驚厥劑量(35mg/kg)腹腔注射,每日1次,持續28天,正常對照組以等容生理鹽水代替PTZ腹腔注射。靈芝孢子粉組腹腔注射PTZ的同時再經灌胃給予靈芝孢子粉(A組：150mg/kg;B組：300mg/kg;C組：450mg/kg),灌胃前禁食 6h,灌胃體積為10.0ml/kg,每日 1次,持續28天;癲癇模型組和空白對照組同時經灌胃給予同體積生理鹽水。大鼠癲癇發作評分標準按Ono法[3]：0級,無任何發作反應;Ⅰ級,節律性點頭或面部抽動;Ⅱ級,陣攣性咀嚼或者點頭甩尾;Ⅲ級,頭部顫搐加前肢陣攣性抽搐;Ⅳ級,袋鼠姿勢或多肢抽動;Ⅴ級,失去平衡,跌倒;Ⅵ級,全面持續強直-陣攣發作。每天對每只鼠在PTZ注射后觀察30～60min,并記錄癲癇發作的級別。停藥1周,再用相同劑量的PTZ測試,誘發癲癇發作,凡出現連續5次Ⅱ級或Ⅱ級以上驚厥發作的大鼠為達到點燃標準的動物模型。

1.4 取材及wtp53免疫組織化學檢測 乙醚麻醉斷頭處死大鼠,取腦,立即分離出海馬區組織,吸去血跡,置于4%多聚甲醛溶液固定,常規石蠟包埋,6μ m切片備檢。石蠟切片經常規脫蠟水化后,用過氧化物酶阻斷劑阻斷內源性過氧化物酶活性,PBS沖洗后,用成套sABC免疫組織化學試劑盒檢測wtp53表達水平。一抗分別為兔抗大鼠wtp53抗體,以PBS代替一抗作陰性對照,孵育切片。具體操作步驟按sABC免疫組織化學試劑盒說明書進行。DAB顯色,蘇木素復染,脫水,透明,封片。于光鏡下觀察wtp53陽性細胞的表達情況,應用彩色病理圖文分析系統進行圖像分析,每張切片海馬CA1區隨機選取6個具有代表性的非重疊高倍視野,在顯微鏡下(×400)微尺計數海馬CA1區線性1mm長度的wtp53陽性細胞,并計算平均陽性細胞數。

2 結果

2.1 行為學觀察 癲癇模型組及靈芝孢子粉用藥各組大鼠在注射亞驚厥劑量PTZ后第6天開始出現發作反應,均有連續多次Ⅲ～Ⅵ級的癲癇發作,每次發作持續1～20min不等。上述各組實驗動物均達到點燃標準,癲癇模型復制成功?？瞻讓φ战M大鼠則無異常行為改變。

2.2 各組大鼠海馬CA1區神經細胞wtp53蛋白表達結果 40×10倍光鏡下,細胞核有濃染的深棕褐色為wtp53免疫陽性細胞。癲癇模型組與空白對照組比較,wtp53免疫陽性細胞數明顯增多(P＜0.01),免疫反應增強;靈芝孢子粉高劑量用藥C組與癲癇模型組比較,wtp53免疫反應性減弱,陽性細胞數明顯減少,僅呈散在分布,差異有顯著性(P＜0.05);以PBS代替一抗的對照反應均為陰性。結果見表1。

表1 各組海馬CA1區wtp53蛋白表達水平 (±s)

表1 各組海馬CA1區wtp53蛋白表達水平 (±s)

與對照組比較,a：t=22.76,P＜0.01;與模型組比較,b：t=1.55,c：t=1.87,P 均＞0.05;d：t=5.13,P＜0.05

組別 用藥劑量(mg/kg) n wtp53陽性細胞數對照組 同體積生理鹽水 12 3.26±2.39模型組 同體積生理鹽水 12 55.72±7.62a用藥A組 150 12 51.29±6.31b用藥B組 300 12 47.33±13.52c用藥C組 450 12 38.74±8.56d

3 討論

p53基因分為野生型和突變型兩種,突變型p53(mtp53)基因是一種癌基因,可以促進癌瘤的發生發展;野生型p53基因存在于細胞內,為一種抑癌基因,一方面具有轉錄因子功能,對細胞的生長分化進行調控,同時也作為某些抑制細胞增殖基因的反式激活因子對細胞分裂進行負調控,另一方面它監視著細胞基因的完整性,抑制細胞周期推進以及誘導細胞凋亡。有研究顯示[4],wtp53基因誘導細胞凋亡的可能機制為：降低細胞內源性Bcl-2蛋白表達并抑制其功能,Bcl-2基因作為重要的凋亡調控基因,可通過抑制線粒體膜tbid插入、Bax轉位和Bax/Bax寡聚化起到抑制細胞凋亡的作用;wtp53基因還可連接于Bax啟動子上,提高細胞中Bax的表達,使Bcl-2/Bax比例失調,從而促進細胞凋亡,因此,Bax可作為wtp53立刻早期反應基因。

另有研究表明[5],PTZ致癇后大鼠海馬CA1區wtp53蛋白大量表達出現的最早時間和高峰時間與原位末端標記(TUNEL)法檢測到的神經細胞凋亡反應時序相吻合,陽性反應區域相同。大量凋亡的錐體細胞內wtp53蛋白陽性表達明顯增多[6],本實驗結果也進一步證實了wtp53基因參與了癲癇發作后海馬區神經細胞凋亡的過程。癲癇發作可使腦細胞內外環境發生劇烈變化,從而導致腦組織損傷。癲癇發作后神經細胞發生凋亡,wtp53基因在此過程中可起到重要的調控作用。

靈芝是一種珍貴的藥用真菌,富含靈芝多糖、多肽、有機鍺等成分,對神經系統具有調節功能,可使肌肉松弛,減少動物自發活動,對抗電驚厥,有鎮靜、鎮痛、降低副交感神經的興奮性等作用[7]。本實驗經灌胃給與大鼠靈芝孢子粉后,高劑量用藥組大鼠較癲癇模型組海馬區wtp53蛋白表達明顯減少(P＜0.05),說明靈芝孢子粉對誘導癇性發作后的神經細胞凋亡具有抑制作用,其抑制凋亡的分子機制可能是通過下調wtp53蛋白表達實現的,這為靈芝孢子粉作為一種治療癲癇的輔助用藥,改善腦部功能,對腦組織具有一定保護作用提供了新的依據。

[1]Zhao S,Wang SQ,Zhang SC,et al.Effect of ganoderma lucidum spores powder on the expression of IGF-1、NF-κ B and the apoptosis of nerve cells in the epileptic rat brain[J].Neural Regeneration Research,2008,3(8)：858-862.

[2]Shapleske J,Rossell SL,Woodruff PW,et al.The planum temporale：a systematic,quantitative review of its structural,functional and clinical significance[J].Brain Res Brain Res Rev,1999,29(1)：26-49.

[3]Yue W,Liu YX,Zang DL,et al.Inhibitory effects of succinic acid on chemical kindling and amygdala electrical kindling in rats[J].Acta Pharmacol Sin,2002,23(9)：847-850.

[4]Yi X,Yin XM,Dong Z.Inhition of bid-induced apoptosis by Bcl-2：tbid insertion,Bax translocation and Bax/Bax oligomerization suppressed[J].J Biol Chem,2003,278(19)：16992-16999.

[5]程桂玲,呂涌濤,遲兆富,等.戊四氮致癇大鼠腦p53蛋白表達與神經細胞凋亡關系的研究[J].中風與神經疾病雜志,2002,19(5)：291-293.

[6]陳利鋒,柯以銓,王松青,等.小劑量3-NPA對KA致癇大鼠海馬神經細胞凋亡和p53蛋白表達的影響[J].中華神經醫學雜志,2005,4(10)：987-990.

[7]周子懿,唐宇平,金惠銘,等.靈芝防治神經系統疾病的實驗研究進展[J].上海中醫藥雜志,2008,42(7)：92-94.