蛋白激酶在Cx40、Cx43調節缺氧處理大鼠腸系膜上動脈收縮反應性中的作用*

明 佳,李 濤,徐 競,楊光明,張 瑗,劉良明

（第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所第二研究室/創傷、燒傷與復合傷國家重點實驗室,重慶400042）

血管內皮細胞（vascular endothelium cell,VEC）是襯覆于血管腔面的單層鱗狀上皮細胞,它除了具有屏障功能和參與物質交換的功能外,還具有活躍的代謝和內分泌功能,特別是它合成、釋放的血管舒張和收縮因子,與神經、體液因子一起,共同參與了全身血管張力的維持和調節?？p隙連接是存在于相鄰細胞間的一種膜通道結構[1],VEC和血管平滑肌細胞間存在著縫隙連接,即肌-內皮縫隙連接（myo-endothelial gap junction,M EGJ）,M EGJ可以穿過血管內彈力層,使VEC和血管平滑肌細胞進行雙向性的、直接的電化學交流[2-3],參與了血管緊張性的調節?？p隙連接的基本組成單位是連接蛋白（connexin,Cx）,VEC同時表達Cx37、Cx40和Cx43[4]；血管平滑肌細胞協同表達Cx37、Cx40、Cx43和Cx45[4]。

嚴重休克失代償期常出現血管低反應性,其主要表現為全身血管對舒/縮血管物質的反應減弱或不反應,目前對其發生機制尚不完全清楚。本研究的前期研究發現,Cx40、Cx43通過cAM P-PKA、cGMP-PKG、DG-PKC信號通路參與了休克后內膜依賴的血管收縮反應性的調節[5]。具體表現在：Cx40可以增加血管cAMP、cGMP的濃度和蛋白激酶A（PKA）、蛋白激酶C（PKG）的活性,降低二酰甘油（DG）的濃度、蛋白激酶C（PKC）的活性和血管內膜依賴的收縮反應性；Cx43可以降低血管cAM P、cGMP的濃度和PKA、PKG的活性,增加DG的濃度、PKC的活性和血管內膜依賴的收縮反應性。但是，Cx40/43是如何通過PKA、PKG、PKC參與了血管鈣敏感性和收縮反應性的調節目前尚不清楚,也未見相關的文獻報道。本實驗模擬休克缺氧損害,以SD大鼠的腸系膜上動脈（superior mesenteric artery,SMA）為研究對象,以Cx40/43的反義寡脫氧核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide,AODN）阻斷SMA的Cx40/43表達,在此基礎上觀察PKA、PKG、PKC的特異性激動劑和拮抗劑對不同程度缺氧SMA的肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase,MLCK）、肌球蛋白輕鏈磷酸酶（myosin light chain phosphotase,M LCP）活性和內膜依賴的收縮反應性的影響,希望通過本研究探索M EGJ調節失血性休克后血管收縮反應性的可能機制。

1 材料與方法

1.1 標本的制備 Sprague Dawley大鼠[SD大鼠,體質量（270±10）g,雌雄不限]購于第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所動物中心。主要藥品：8-Br-cAMP、8-Br-cGMP、PM A、H-89、KT-5823、staurosporine、楊梅黃酮（myricetin）、乙酰膽堿（acetylcholine,Ach）均購自美國Sigma公司。主要儀器：恒溫離體器官灌流浴槽購自西班牙Leitca Scientific Instruments公司,肌張力換能器及八道生理記錄儀購自澳大利亞AD Instrument公司。

按照文獻[6]的方法,無菌條件下取正常 SD大鼠的SM A,制成SMA血管環,隨機分為常氧組、缺氧1h組和缺氧3h組,每組又分為對照亞組、Cx40/43AODN處理亞組、Cx40/43AODN聯合蛋白激酶激動劑處理亞組、Cx40/43AODN聯合蛋白激酶抑制劑處理亞組,每組8根血管或血管環。蛋白激酶激動劑分別為8-Br-cAMP（10-6mol/L,PKA激動劑）、8-Br-cGMP（10-4mol/L,PKG激動劑）、PMA（10-7mol/L,PKC激動劑）；蛋白激酶抑制劑分別為 H-89（10-6mol/L,PKA抑制劑）、KT-5823（10-6mol/L,PKG抑制劑）、staurosporine（10-7nmol/L,PKC抑制劑）。

將SMA血管環進行Cx40/43AODN轉染、不同程度缺氧[5]、分別與 PKA、PKG、PKC特異性激動劑或拮抗劑孵育10min后,檢測血管對楊梅黃酮（myricetin,內膜依賴性的血管收縮劑[7],工作濃度10-4mol/L）的收縮反應；另一部分血管在與10-4mol/L的 myricetin孵育 30min后,用于 M LCP、MLKC活性的檢測。

1.2 內膜依賴的血管收縮反應性的測定 將轉染或未轉染Cx40/43AODN、常氧或缺氧處理的 SMA環懸掛于注有Krebs-Henseleit重碳酸鹽緩沖液[8-9]的離體器官灌流浴槽中,支架與肌張力換能器相連,按文獻[8-9]的方法37℃孵育2h,待張力曲線平穩后,分別加入 8-Br-cAMP（10-6mol/L）、8-Br-cGMP（10-4mol/L）、PM A（10-7mol/L）、H-89（10-6mol/L）、K T-5823（10-6mol/L）、staurosporine（10-7nmol/L）孵育 10min后,加入 myricetin（10-4mol/L）觀察SM A收縮力的變化。血管收縮力（g/mg）=加myricetin后血管環收縮力的增加值（g）/血管環質量（mg）。為了檢測血管內膜的完整性,以去甲腎上腺素（終濃度為10-6mol/L）誘導血管環收縮至穩定的平臺期后,加入終濃度為10-6mol/L的二酰膽堿（Ach）,以血管環舒張程度（%）評價血管舒張反應性,舒張程度超過70%表示血管內膜完整[10],本實驗用的血管環均在舒張程度大于75%的條件下進行。血管環舒張程度（%）=（加Ach后血管張力的下降幅度/加去甲腎上腺素后血管張力的上升幅度）×100%。

1.3 M LCP活性測定 按常規方法提取血管總蛋白,取10μ L蛋白加入240μ L蛋白稀釋液（T ris-HCl 25mmol/L,乙二胺四乙酸（EDTA）0.1mmol/L,0.1%β-巰基乙醇）混勻,取40μ L加入10μ L磷酸化myosin,25℃反應15min；以5%三氯乙酸100μ L、5mg/mL牛血清清蛋白25μ L終止反應；13000×g離心3min；取100μ L反應混合液進行液閃計數測定cpm值。同時取10μ L磷酸化myosin測定cpm值,以從磷酸化Myosin脫去的iP表示M LCP活性。

1.4 M LCK活性測定 按常規方法提取血管總蛋白,取30μ L蛋白加入60μ L酶反應緩沖液（T ris-HCl 30mmol/L pH7.4,KCl 50mmol/L,MgCl21mmol/L,4-硝基苯磷酸二鈉（PNPP）60mg/mL,PKA抑制劑0.2mg/mL,[γ-32P]-A TP 0.2mmol/L,CaCl21mmol/L,CaM 50μ g/mL,myosin 2mg/mL）,混勻,25℃反應3min；加5%三氯醋酸液10μ L終止反應；吸取20μ L反應液進行液閃計數測定cpm值。

1.5 統計學處理 采用SPSS11.0統計軟件進行數據統計,統計結果以±s表示,各組間均數比較行ANOVA方差分析和Post hoc檢驗（S-N-K/LSD）,自身均數比較行配對t檢驗,相關性分析采用Pearson correlation檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PKA、PKG、PKC對Cx40/43AODN調節缺氧血管內膜依賴的收縮反應性的影響 與常氧組的對照亞組比較,缺氧1h組血管對myricetin的收縮反應性明顯升高；缺氧3h組則明顯降低。Cx40AODN可以明顯增加血管的收縮反應性；Cx43AODN可以明顯降低血管的收縮反應性。8-Br-cAMP、8-BrcGMP和staurosporine可以部分或完全拮抗Cx40AODN的作用,增強Cx43AODN的作用,明顯降低Cx40/43AODN處理血管的收縮反應性；H-89、KT-5823和PMA可以部分或完全拮抗Cx43AODN的作用,增強Cx40AODN的作用,明顯增加Cx40/43AODN處理血管的收縮反應性（圖1）。

圖1 PKA、PKG、PKC對Cx40/43AODN調節缺氧血管收縮反應性的影響

2.2 PKA、PKG、PKC對Cx40/43AODN調節缺氧血管M LCP活性的影響 與常氧組的對照亞組比較,缺氧1h組M L-CP活性明顯降低,缺氧3h組血管的M LCP活性明顯升高。Cx40AODN可以明顯降低血管的MLCP活性；Cx43AODN可以明顯升高血管的MLCP活性。8-Br-cAM P、8-Br-cGMP和staurosporine可以部分或完全拮抗Cx40AODN的作用,加強Cx43AODN的作用,明顯增加Cx40/43AODN處理血管的MLCP活性；H-89、KT-5823和PMA可以加強Cx40AODN的作用,拮抗Cx43AODN的作用,明顯降低Cx40/43AODN處理血管的MLCP活性（圖2）。

圖2 PKA、PKG、PKC對Cx40/43AODN調節缺氧血管M LCP活性的影響

2.3 PKA、PKG、PKC對 Cx40/43AODN調節缺氧血管MLCK活性的影響 缺氧1h組血管的M LCK活性較常氧組的對照亞組明顯升高（P＜0.01）,缺氧3h組M LCK活性明顯降低,myricetin、Cx40/43AODN對各組血管M LCK活性無明顯影響（圖3）。

圖3 Cx40/43AODN對缺氧處理血管M LCK活性的影響

3 討論

嚴重休克失代償期常出現血管低反應性,其主要表現為全身血管對舒/縮血管物質的反應減弱或不反應,目前認為其發生機制主要與血管平滑肌細胞膜上的腎上腺素能受體失敏、細胞膜超極化和血管平滑肌細胞對鈣的敏感性降低等三大因素有關[11]。但是,應用一氧化氮合酶抑制劑（如L-硝基精氨酸甲酯）[12]、KATP抑制劑（如格列本脲）[13]、以及鈣增敏劑（如血管緊張素-Ⅱ）[11]只能部分恢復而不能完全逆轉休克血管的反應性。前期研究發現,VEC通過Cx40/43參與了休克血管MLCP活性和MLC20磷酸化水平的調節,進而參與了對失血性休克后SMA內膜依賴的收縮反應性的調節[6]。

本實驗采用離體血管環研究發現,因缺氧時間不同,血管的MLCP活性和收縮反應性發生不同變化：缺氧1h的血管處于高收縮反應期,血管的MLCP活性降低；缺氧3h的血管處于收縮低反應期,血管的 M LCP活性增加。myricetin和Cx40AODN可以降低正常血管和缺氧血管的M LCP活性,增加內膜依賴的血管收縮反應性；Cx43AODN可以增加血管的MLCP活性,抑制血管內膜依賴的收縮反應性。有研究表明,肌球蛋白是一種由肌動蛋白激活的Mg2+-ATP酶,其分子由2條重鏈和4條輕鏈組成,2條重鏈的氨基酸末端分別含有一個ATP水解部位和一個肌動蛋白結合位點,4條輕鏈分別為2條調節輕鏈（20kD）和 2條必需輕鏈（17kD）,M LC20受MLCK/M LCP催化發生磷酸化/脫磷酸化。外界刺激通過形成Ca2+-鈣調蛋白（calmodulin,CaM）復合物激活MLCK,后者可以磷酸化M LC20,導致平滑肌收縮,此為M LC20磷酸化的鈣依賴性途徑；外界刺激通過抑制MLCP的活性,使M LC20去磷酸化作用減弱而導致血管收縮的途徑為非鈣依賴性途徑。本實驗結果顯示,myricetin、Cx40/43AODN對缺氧血管MLCK活性無明顯影響,Cx40/43可能通過調節MLCP活性的非鈣依賴途徑調節休克后SMA內膜依賴的收縮反應性。

作者的前期研究發現,Cx40、Cx43通過 cAMP-PKA、cGMP-PKG、DG-PKC信號通路參與了休克后內膜依賴的血管收縮反應性的調節[7]。具體表現在：Cx40可以增加血管cAM P、cGMP的濃度和PKA、PKG的活性,降低DG的濃度、PKC的活性和血管內膜依賴的收縮反應性；Cx43可以降低血管cAMP、cGMP的濃度和PKA、PKG的活性,增加DG的濃度、PKC的活性和血管內膜依賴的收縮反應性。本研究發現，myricetin和Cx40/43AODN對M LCP和血管收縮反應性的作用受 PKA、PKG、PKC的調節,具體表現為 8-Br-cAMP、8-Br-cGM P和staurosporine可以明顯增加Cx40/43AODN處理血管的M LCP活性,明顯降低Cx40/43AODN處理血管的收縮反應性；用H-89、KT-5823和PMA拮抗PKA、PKG,激活PKC后可以明顯降低Cx40/43AODN處理血管的MLCP活性,明顯增加Cx40/43AODN處理血管的收縮反應性。說明Cx40抑制血管內膜依賴的收縮反應性與其降低PKC活性、增加PKA和PKG活性、進一步通過后者調節MLCP的活性有關；Cx43促進血管內膜依賴的收縮反應性的機制與其增加PKC活性、抑制PKA和PKG活性、進而調節MLCP的活性有關。

綜上所述,Cx40/43可能通過PKA、PKG、PKC信號通路調節血管M LCP的活性,進而參與了休克血管鈣敏感性和血管內膜依賴的收縮反應性的調節,但是Cx40/43調節PKA、PKG、PKC及M LCP的具體機制還有待進一步的深入研究。

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