雞源性沙門氏菌氟喹諾酮類耐藥株與拓撲異構酶IV關系研究

劉芳萍，李昌文，劉立新，李 睿，羅鵬志，盧斯亮，張秀英

（1.東北農業大學動物醫學學院，哈爾濱 150030； 2.中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所，哈爾濱 150001）

雞沙門氏菌病是危害我國養禽業健康發展的重要疾病之一，在雛雞中具有較高的發病率和死亡率，成年雞則嚴重影響其生產性能。目前主要使用抗菌藥物對該病進行預防和治療。氟喹諾酮類藥物為一類化學合成的廣譜、高效、低毒的抗菌藥物。隨著該類藥物的長期應用及不當使用，雞沙門氏菌對其耐藥性也隨之廣泛產生，且耐藥率呈逐年升高的趨勢[1-3]。耐藥性的產生導致預防和治療的失敗，給養禽業帶來巨大的經濟損失。而且，耐藥性可通過食物鏈傳遞給人群，也嚴重危害著人類的健康。

研究表明，沙門氏菌對氟喹諾酮類產生耐藥的原因與氟喹諾酮類藥物作用的靶位-DNA旋轉酶（由gyrA和gyrB基因編碼）和拓撲異構酶Ⅳ（由parC和parE基因編碼）發生改變有一定的相關性。DNA旋轉酶和拓撲異構酶IV各亞基上都有一與喹諾酮類藥物耐藥性產生有關的保守區域，稱為喹諾酮類藥物耐藥決定區（Quinolone resistance-determining region，QRDR），此區域內的基因突變導致相應氨基酸變異是引起喹諾酮類藥物耐藥的關鍵因素[4-5]。關于DNA旋轉酶與氟喹諾酮類藥物耐藥性的關系已有另文詳述[6]。本文針對臨床分離的9株對5種氟喹諾酮類藥物（環丙沙星、氧氟沙星、恩諾沙星、單諾沙星和沙拉沙星）耐藥水平較高的雞源性沙門氏菌拓撲異構酶IV進行研究，分析耐藥基因突變與耐藥性產生的關系，探討雞源性沙門氏菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥機制，為進一步研究沙門氏菌的耐藥機制打下了基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株

質控菌株:雛雞沙門氏菌NCTC5776，購自中國藥品生物制品檢定所。

試驗菌株:雞源性沙門氏菌氟喹諾酮類耐藥株37、38、42、55、60、61、68、217和251，由齊齊哈爾、吉林、雙城等地的病雞糞便樣本分離所得。

1.2 藥品與試劑

pMD18-T載體、Ex Taq DNA聚合酶、限制性內切酶Eco RⅠ和HindⅢ、蛋白酶K、反轉錄酶、DNAmarker DL2000等均購自TaKaRa公司；DNA片段凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司。

1.3 引物設計

圖1 parC基因片段PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification product of parC gene

根據GenBank中鼠傷寒沙門氏菌LT2全基因序列，上游引物parCF:5′TAA TGA GCG ATA TGG CAG AG 3′，下游引物 parCR:5′GGT AAC ATT TTC GGT TCC TG 3′，引物位于parC基因序列的14～469bp；上游引物 parEF:5′TAA TCG GAC CGA GCT GTT CC 3′，下游引物 parER:5′TGC ATC GGG TTC ATT TCT CC 3′，引物位于parE基因序列的1227～1699bp處。擴增的區域涵蓋了氟喹諾酮類藥物耐藥性決定區（QRDR）。

1.4 parC基因和parE基因的擴增

PCR體系25μL:染色體DNA 1.0μL，10×Ex Taq Buffer（Mg2+plus）2.5μL，dNTPs Mixture（各 2.5 mmol·L-1）2.0μL，上下游引物（10 pmol·μL-1）各0.5μL，Ex Taq（5 U·μL-1）0.2μL。parC 基因的PCR反應參數為:95℃熱啟動10 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環；最后72℃溫育10 min。parE基因的PCR反應參數為:95℃熱啟動10 min；94℃變性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環；最后72℃溫育10 min。

1.5 PCR產物的克隆及序列分析

PCR產物用凝膠回收試劑盒回收后，克隆到pMD18-T載體上。提取質粒，用Eco RⅠ和HindⅢ進行雙酶切鑒定。

由上海聯合基因科技有限公司測序，測得的核苷酸序列用DNASIS和DNAmaN軟件分析。

2 結果與分析

2.1 沙門氏菌parC基因和parE基因片段擴增結果

擴增parC基因片段大小為475bp，擴增parE基因片段大小為492bp。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖1、2，在500～750bp處出現特異的目的片段，與預計的片段大小基本一致。

圖2 parE基因片段PCR擴增結果Fig.2 PCR amplification product of parE gene

2.2 parC基因測序結果及分析

臨床分離雞源性沙門氏菌氟喹諾酮類耐藥菌株與質控菌株和GenBank數據庫登錄的鼠傷寒沙門氏菌LT2株parC基因片段核苷酸序列比較見表1。

9株臨床分離耐藥株與質控菌株和LT2株的parC基因QRDR的核苷酸及氨基酸序列完全相同。

2.3 parE基因測序結果及分析

臨床分離雞源性沙門氏菌氟喹諾酮類耐藥菌株與質控菌株和GenBank數據庫登錄的鼠傷寒沙門氏菌LT2株parE基因片段核苷酸序列比較見表2。

表1 10株雞源沙門氏菌parC基因核苷酸序列與鼠傷寒沙門氏菌LT2株比較Table1 Nucletide sequence comparing of parC genes between ten chicken origins and Salmonella typhimurium LT2

表2 10株雞源沙門氏菌parE基因核苷酸序列與鼠傷寒沙門氏菌LT2株比較Table2 Nucletide sequence comparing of parE genes between ten chicken origins and Salmonella typhimurium LT2

質控菌株與GenBank數據庫登錄的鼠傷寒沙門氏菌LT2的parE基因QRDR的核苷酸序列有幾處不同，包括C-1341→T、G-1347→A、A-1380→G、C-1527→T、A-1569→G。與質控菌株相比，9株臨床分離得到的雞源性沙門氏菌氟喹諾酮類耐藥株中菌株37、55和60的parE基因QRDR發生單堿基突變，包括菌株37的T-1434→C、菌株55的T-1434→C和菌株60的T-1517→C，此外菌株55的parE基因第1341位為C、第1380位為A，與NCTC5776不同，但與LT2相同。

利用DNAmaN軟件將核苷酸序列翻譯成氨基酸序列，與GenBank數據庫登錄的鼠傷寒沙門氏菌LT2的氨基酸序列進行比較分析。質控菌株與LT2的parE基因的QRDR的氨基酸序列完全相同；與質控菌株相比，9株臨床分離耐藥株中只有60的parE基因第506位氨基酸發生F→S（Phe→Ser）取代，且位于QRDR內，其余菌株的氨基酸均未發生變化。

3 討論與結論

氟喹諾酮類藥物作用于革蘭氏陰性菌的首選靶位是DNA旋轉酶（gyrA、gyrB基因），革蘭氏陽性菌的首選靶位是拓撲異構酶IV（parC、parE基因，金黃色葡萄球菌是grlA、grlB基因）。酶的作用機制是大腸桿菌、金葡球菌、銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌和支原體等病原微生物對氟喹諾酮類藥物產生耐藥性的重要機制。

Guerra等從牛體內分離得到的對萘啶酸和環丙沙星耐藥的沙門氏菌中，有一株parC基因發生了Ser80→Ile取代[7]。Baucheron等報道缺失parC基因Ser80→Ile改變能使耐藥鼠傷寒沙門氏菌DT204對氟喹諾酮類的敏感性增加16～32倍[8]。魏秀麗等對沙門氏菌DNA旋轉酶在氟哇諾酮類藥物作用壓力下發生突變進行分析發現[9]，在gyrA基因83和87位雙位點突變的基礎上，parC基因在80位還發生Ser被Arg或lIe代替，加重耐藥性的增長，因此parC基因可能也是氟哇諾酮類藥物的作用位點。Reche等試驗了7株對萘啶酸高度耐藥的沙門氏菌，所有菌株的parC基因未發生任何突變，因而得出parC基因突變對于獲得高水平萘啶酸耐藥株是不必要的[10]。Luke等的研究也沒有發現突變僅出現在parC基因這一現象[11]。本試驗中質控菌株和9株臨床分離株與GenBank數據庫登錄的鼠傷寒沙門氏菌LT2株parC基因QRDR的核苷酸序列和氨基酸序列同源性均為100%。這表明，parC基因在沙門氏菌對氟喹諾酮類藥物產生耐藥性中并不占主導地位。

本試驗中質控菌株與LT2的parE基因QRDR的氨基酸序列同源性為100%，9株臨床分離雞源性沙門氏菌氟喹諾酮類耐藥株中只有菌株60的parE基因第506位氨基酸發生F→S（Phe→Ser）取代，位于QRDR區域內，與質控菌株parE基因QRDR的氨基酸的同源性為99.4%，其余菌株與質控菌株parE基因QRDR的氨基酸的同源性均為100%。關于氟喹諾酮類耐藥沙門氏菌parE基因發生突變未見報道。Giraud等用恩諾沙星通過體外和體內誘導產生沙門氏菌耐藥株來分析耐藥性產生的分子機制，分析結果沒有發現gyrB、parC、parE基因的突變。Hirose等對從1995年到2001年從病人血液或分泌物中分離得到的氟喹諾酮類耐藥腸炎沙門氏菌的gyrA、gyrB、parC、parE基因進行研究，發現所有菌株的gyrB和parE基因均未發生突變[12]。Piddock對人源性和可食動物源性氟喹諾酮類耐藥腸炎沙門氏菌進行研究，沒有發現parC、parE基因的突變位點[13]。本研究中發現的菌株60的parE基因QRDR第506位氨基酸的變異與耐藥水平之間的關系還有待進一步試驗研究。

本研究克隆了parC和parE基因的QRDR，序列分析結果表明，所有耐藥株的parC基因均未發生任何氨基酸改變，只有菌株60的parE基因發生Phe506→Ser氨基酸取代。本次研究表明，parE基因突變與耐藥性雖有一定的關系，但拓撲異構酶Ⅳ的作用機制可能并不是沙門氏菌對氟喹諾酮類耐藥的主要機制，沙門氏菌對氟喹諾酮類藥物產生耐藥性，還存在其他的耐藥機制。

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