白附片對健康及腎陽虛模型大鼠心電圖及心肌組織病理形態的影響*

譚 勇，李 健，呂 誠，肖 誠，許少華，楊 靜，趙宏艷，鞠大宏，呂愛平△

（1.中國中醫科學院中醫臨床基礎醫學研究所，北京 100700；2.北京中醫藥大學基礎醫學院人體形態系，北京 100029；3.衛生部中日友好醫院科研處，北京 100029；

4.中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京 100700）

既往的研究表明，氫化可的松腎陽虛證模型能夠較好地模擬臨床腎陽虛證狀態［1］；白附片可導致健康大鼠和腎陽虛模型大鼠血清和心臟組織中酶學的異常改變，隨著白附片使用的增加，異常程度加重，且與健康大鼠相比，腎陽虛模型大鼠酶學異常改變程度較輕［2-3］。為進一步探索白附片醇提物對健康大鼠和腎陽虛模型大鼠的心臟毒性差異，本研究通過心電圖和心臟組織病理觀察白附片的心臟毒性，從而為基于中醫對證動物模型評價中藥毒性的合理性提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選用SPF級雄性SD大鼠80只，體質量180g～200g，由軍事醫學科學院提供（合格證號 SCXK-（軍）2007-004）。

1.1.2 藥物 造模用藥注射用氫化可的松琥珀酸鈉（天津生物化學制藥有限公司，生產批號20080604），用生理鹽水配成濃度為 71.43mg/ml的溶液；灌胃給藥：白附片（北京燕京飲片廠，生產批號081117，產地四川）用乙醇提取制成 2g生藥/ml的溶液（由中國中醫科學院中醫基礎理論研究所方證研究中心提?。?。

1.1.3 儀器 MP-100型生理實驗信號采集分析系統（美國 BloAP公司），光學顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型建立和分組 80只大鼠適應性喂養7d后隨機分為2組（健康組和模型組）各40只。模型組和健康組中的每只動物每天上午在臀部肌肉豐厚處各自注射0.5ml/kg的氫化可的松琥珀酸鈉溶液和生理鹽水溶液，連續 9d。然后，再把2組動物分別隨機分為低劑量、小劑量、中劑量和大劑量4個給藥組和空白對照組，每組8只。

1.2.2 給藥方法 分組當天對給藥組和空白對照組大鼠分別灌胃給予10ml/kg的白附片溶液和生理鹽水，每天1次，連續14d。給藥組給藥濃度從低到高依次為：0.32g/kg、0.64g/kg、1.28 g/kg 和 2.56 g/kg。

1.2.3 取材 給藥結束后，所有大鼠稱重并于麻醉狀態下采用頸椎脫臼法處死，迅速取出完整心臟稱取濕重，然后切取部分心臟組織浸入4％的甲醛溶液固定。

1.2.4 心電圖檢測 在大鼠給藥的第12天以腹腔注射3％戊巴比妥鈉0.10 ml/100g質量麻醉大鼠后，使其平躺俯臥于平板上，以 Biopac MP多道生理記錄儀描記Ⅱ導聯心電圖，記錄心率（BPM）和峰-峰值（P-P）以及心律失常情況。

1.2.5 組織病理學觀察 固定后的心臟組織行常規脫水、透明、浸蠟、包埋、切片及 HE染色，光鏡觀察并攝片。

1.3 統計學處理

劑量資料，組內各劑量處理組間比較采用單因素方差分析，組間采用廣義線性模型兩因素方差分析；計數資料用卡方檢驗精確概率法和Logistic回歸分析，顯著性水平取 P＜0.05。

2 結果

2.1 造模及白附片給藥對大鼠行為形態的影響

造模致使大鼠精神萎靡、瞇眼、嗜睡，蜷縮、扎堆，對聲音、觸動刺激反應遲鈍，以及出現毛聳而臟、失去光澤的表現。給藥致使大鼠不安走動，易激惹，雙目、口唇紅赤，飲食減少，呼吸急促，模型大鼠的反應較輕。

2.2 白附片對 BPM和 P-P的影響

表1顯示，健康組和腎陽虛證組各組內比較，2組 BPM在給藥劑量為0.64 g/kg時，與各自空白組比較，BPM增大，有顯著性差異（P＜0.05），并隨著劑量的加大，BPM增大的趨勢更明顯，有非常顯著性差異（P＜0.01）；2組 P-P在給藥劑量為 0.32 g/kg時，與各自空白組比較，P-P增大，有顯著性差異（P＜0.05），亦隨著劑量的加大，P-P增大的趨勢更明顯，也有非常顯著性差異（P＜0.01）。健康組與腎陽虛證組組間比較，BPM和 P-P隨著劑量變化在2組間無統計學差異，但與腎陽虛組 BPM比較，健康組BPM隨著劑量增加而增大的幅度更大。

表1 不同劑量白附片對健康和腎陽虛大鼠BPM和P-P的影響比較±sd）

表1 不同劑量白附片對健康和腎陽虛大鼠BPM和P-P的影響比較±sd）

注：各組內比較，與健康空白組比較：*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01；與腎陽虛證空白組比較：▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01

檢測指標 組 別白附片劑量（g/kg）統計結果0 0.32 0.64 1.28 2.56 檢驗參數F P BPM（B） 健康組 379.50 ±36.71 406.00 ±38.24 423.63 ±17.70*436.13 ±19.93＊＊453.88 ±20.39＊＊ 模型檢驗19.78 0主效應：劑量 54.23 0模型組 387.63 ±10.88 403.14 ±20.28 417.57 ±18.72▲ 424.57 ±14.47▲ 433.25 ±13.13▲▲ 主效應：組別 0.15 0.698交互效應 3.15 0.080 P-P（V） 健康組 0.34 ±0.14 0.49 ±0.09* 0.68 ±0.16* 1.21 ±0.69＊＊ 1.29 ±0.42＊＊ 廣義線性模型19.81 0主效應：劑量 58.80 0模型組 0.32±0.14 0.55±0.27▲ 0.99±0.59▲▲ 0.85±0.29▲▲ 1.58±0.65▲▲ 主效應：組別 0.02 0.897交互效應0.38 0.541

2.3 白附片對心律的影響

圖2顯示，白附片對大鼠心律有顯著影響，其影響主要表現為室性早搏、心動過速等（Ⅱ導聯記錄時間間隔4 s）。表2顯示，對2組各劑量心律失常數量進行比較，結果顯示，不同劑量給藥對心律影響不同，劑量越大，心率失常發生率越高；2組間心律失常發生率比較無統計學差異，但與腎陽虛大鼠比較，健康組大鼠心律失常發生率隨著劑量增加而增大的幅度更大。

2.4 白附片對心臟組織形態的影響

圖4顯示，正常心肌著色均勻，肌纖維粗細大小較一致，肌核清晰可見，肌膜及間質細胞數量未見增多，心肌肌漿內未見有粉染粗大顆粒、肌漿凝聚或肌漿溶解，間質內也未見炎細胞浸潤及瘢痕組織形成，間質血管走行及形態結構均正常。給藥劑量為0.32 g/kg時，2組心臟組織無病理形態學改變；給藥劑量為0.64 g/kg時，健康組心肌著色不均，可見心肌血管擴張充血，模型組心肌纖維波浪樣走行，偶見有空泡樣變性；給藥劑量為 1.28g/kg時，健康組心肌著色不均，有處可見心肌纖維波浪樣走行及心肌纖維消失，其內伴有淋巴細胞浸潤，模型組心肌間隔增寬、水腫、血管擴張充血；給藥劑量為2.56 g/kg時，健康組心肌著色不均，伴有肌漿溶解、血管擴張充血、心肌間隔增寬、水腫，伴有散在的淋巴細胞浸潤，有處可見灶狀心肌出血、肌纖維消失，其內伴有單核、中性粒細胞浸潤，模型組心肌著色不均，血管擴張充血，有處可見灶狀心肌出血。

表2 不同劑量白附片引起健康和腎陽虛大鼠心率失常情況比較

圖4 大鼠心臟組織形態學改變

3 討論

治療作用與不良反應是藥物本身所固有的兩重性作用，強烈的不良反應表現為藥物的毒性。產生毒性的原因是藥物選擇性作用差、作用所涉及的范圍廣泛。當其某一效應被用作治療目的時，其他效應就有可能成為毒性作用。機體的生理病理狀況、性別、年齡、遺傳因素、用藥劑量、用藥時間、藥物相互作用、環境因素以及機體的自身內環境的穩定情況均可影響藥物毒性反應的發生［4］。因此，臨床治療疾病必須充分考慮用藥的安全性和有效性，根據治療需要權衡利弊，決定取舍，才能有效地避免藥物的毒性反應。

中醫有“有故無殞”的臨床用藥理論。這個理論闡述的實質是：只要針對適應證，藥物的不良反應甚或毒性反應會降低?！搬槍m應證”，對中醫而言就是對證，藥證相應是避免中藥毒性反應的必要條件。而目前多采用健康動物評價中藥的毒性，這與中醫臨床實踐不相符。因此，所得的評價結果不足以充分、合理地說明中藥的毒性。鑒于此，我們提出“在對證狀態下評價中藥毒性”的假說。藥物的毒性評價主要包括臨床前和臨床中兩方面的評價，其中臨床前評價是前提和基礎。臨床前評價是主要基于各種動物體內實驗探索藥物的毒性以及毒性機理的過程。因此，我們首先通過動物實驗來印證假說。

白附片為毛茛科多年生草本植物烏頭的子根加工品。其性剛烈迅捷，走而不守，通上達下，行表徹里，有上助心陽、中溫脾陽、下補腎陽之殊功，被譽為“回陽救逆第一品藥”。雖然白附片有獨特、迅捷的療效，但強烈的毒性反應限制它在臨床上的廣泛應用?，F代研究表明，白附片中的雙酯二萜生物堿具有心臟毒性，心律失常是最典型的表現，以頻發室早最常見，且為多源性，并易形成二聯律及陣發性室速、扭轉型室速，甚至發展為室顫［5］。毒性病理學評價是藥物臨床前毒性評價中最基本的環節，觀察病理形態學改變是評價毒性的金指標［6］。既往有研究表明，白附片可導致心肌細胞凋亡，使心肌細胞肌原纖維溶解、斷裂，線粒體增生，肌質網擴張，閏盤扭曲，膜斷裂［7、8］。鑒于白附片具有明確療效和典型毒性反應以及現代研究基礎，我們選擇白附片作為研究對象，重點研究心臟毒性，把觀察心律失常情況和心臟組織病理形態學改變作為觀測的重點，探索其對健康和腎陽虛對證模型大鼠心臟毒性差異，以印證假說。

本研究結果表明，白附片導致健康和模型大鼠BPM和P-P增大以及心律失常，這與白附片使迷走神經興奮、心肌細胞鈉鈣通道障礙、心臟電位紊亂等有關［9-11］。隨著白附片劑量的增加，健康和模型大鼠BPM、P-P和心律失常的程度加重，顯示出顯著的劑量依賴性。雖然2組之間沒有統計學差異，但是與模型大鼠比較，卻表現出健康大鼠心電圖異常程度更重的趨勢。若下一步研究加大樣本量，可能出現2組之間的統計學差異。心臟組織形態學觀察發現，白附片致使健康和模型大鼠心臟病理損傷也存在劑量依賴性，病損程度隨著劑量的增加而加重，且同一給藥劑量時，2種大鼠心臟病理改變存在明顯的差異，模型大鼠病理改變相對較輕?？傊?，以上結果為“白附片對腎陽虛證大鼠的心臟毒性低于健康大鼠的心臟毒性”假設提供了一定的動物實驗依據。

結合我們以往的研究結果可以推論，針對對證動物模型，有毒中藥的毒性反應相對較小。這不僅證明證候作為一種機體狀態，是影響藥物是否產生毒性的重要因素，而且說明在對證狀態下才能全面、準確地評價中藥的毒性。既往的研究發現了“基于中醫證候理論評價中藥毒性”的合理性，但這僅僅說明了一種客觀存在的現象，其科學基礎何在，有待進一步深入探討。中藥具有多成分、多方向和作用多靶點的特點［12］，證候呈現動態、多維的網絡關系［13］，因此在對證狀態下評價中藥的毒性機制，必然要采用系統、網絡化的方法?，F代系統生物學的發展為中藥毒性的深入研究提供了新技術和新方法，采用組學、生物信息學、網絡信息學、數據挖掘等新興的交叉學科技術，發掘、優化和完善評價方法，全方位探索中藥的毒性及其內在機制，不僅將推動中醫藥的現代化，也將為現代藥物研究提供新思路。

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△同等貢獻作者