基于方證相應學說探尋腎陰虛證的標志蛋白質*

李俊麗，李 涢，劉銘福，張 杰

（中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京 100700）

本研究以中醫方證相應學說為依據，運用蛋白質組學技術來探尋腎陰虛證標志蛋白質，以求在蛋白質表達水平發現腎陰虛證的物質基礎，為證本質的研究開辟一條新的研究途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 昆明系小鼠，雄性，購自中國中醫科學院動物室。

1.1.2 方劑組成及處理 左歸飲：由熟地12g，山藥 6g，枸杞子 6g，炙甘草 3g，茯苓 6g，山萸肉5g組成，上述中藥冷水浸泡30min，煎煮2遍和并煎液，濃縮為 100ml，含生藥 0.38g/ml。

1.1.3 主要試劑 丙烯酰胺（Arc）、甲叉雙丙烯酰胺（Bis）、三（羥甲基）氨基乙烷（Tris）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、四甲基乙二胺（TEMED）、過硫酸胺（APS）、二硫蘇糖醇（DTT）、碘代乙酰胺（IAA）、尿素均為Sigma公司產品；硫脲為Fluka公司產品；硫代硫酸鈉、無水碳酸鈉、乙醇、冰醋酸、甘氨酸均為國產分析純；固相 pH梯度干膠條（IPG dry strip PH3～10NL，18cm）及其 IPG緩沖液、蛋白酶抑制劑及蛋白酶標準及考馬斯亮藍均購自GE公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 昆明系雄性18月齡小鼠，隨機分為左歸飲組和老年腎虛證模型組，每組20只。左歸飲組：將左歸飲以8倍人劑量以灌胃形式給予小鼠，每日1次，每灌服6d停藥1d，連續給藥2個月。停止給藥時，小鼠達20月齡。老年腎虛模型組：以同體積水灌胃小鼠，方法同給藥組。青年正常對照組：選用2月齡小鼠為青年正常對照組。

1.2.2 動物取材及蛋白質提取 給藥結束后，取小鼠其血清、肝、腎、睪丸組織，置于-80℃保存備用。蛋白質提?。悍謩e快速取各組小鼠肝、腎、睪丸組織約150mg，于液氮中迅速研磨。研磨后轉入eppendorf管中，加入 0.5ml組織裂解液（（Tris（40mM），尿素（7M），硫脲（2M），4％CHAPS（兩性離子去污劑），1％二硫蘇糖醇，乙二胺四乙酸二鈉（1mM））。同時加入 1 ×Cocktail（混合物）蛋白酶抑制劑。將含裂解液的eppendorf埋入冰中，超聲破碎，3～4s/次，間隔 10s左右，至溶液透明。加入DNase I（10μ /μl）、RNase A（10μ /μl）各 5μl，4℃ 靜置 30min。4℃14000r/min，離心 30min。血清去高峰度蛋白處理：選用德國 QIAGEN生產的 Albumin and IgG Depletion試劑盒處理血清高峰度蛋白。取少量上清用 Bradford法測定蛋白濃度，其余上清-80℃保存。

1.2.3 雙向凝膠電泳 第一向等電聚焦（IEF）：使用 pH3～10NL，18cm IPG預制膠條，在IPG 持膠槽中加入 7μL DTT（1M），1.75μL IPG 緩沖液（pH3～10），組織蛋白提取物（含500μg蛋白），最后加入重泡脹液（8M尿素，4％CHAPS），使總體積為350μL。將IPG膠條置入持膠槽中于聚焦儀上進行等電聚焦電泳。電泳條件為：重泡脹（不加電壓）1h；30V電壓 10h；500V、2000V、5000V電壓各30min；最后穩定在8000V下進行，總電壓時間積為8萬 Vh。

第二向SDS-PAGE使用自制凝膠在Ettan DALT six Electrophoresis Unit上進行電泳。第一向聚焦后的膠條，分別在平衡A液（1mM DTT，50mM Tris pH 8.8 ，6mM 尿素，30％ 甘油，2％SDS ，0.002％ 溴酚蘭）與平衡 B液（2.5％碘乙酰胺，50mMTris pH 8.8 ，6mM 尿素，30％ 甘油，2％SDS，0.002％ 溴酚蘭）中各平衡15min。將平衡后的 IPG膠條轉移至13％的聚丙烯酰胺凝膠上端，使IPG膠條與凝膠上端緊密貼合，在一端加入凝膠電泳蛋白質標準品。電泳條件為：每膠20mA 40min后再以每膠30mA電泳，直至溴酚蘭指示線到達凝膠底邊處停止電泳。

1.2.4 考馬斯亮藍染色 電泳結束后取出膠版，考馬斯亮藍 R-350染色液（0.1％）染色1h，考馬斯亮藍脫色液（7％乙酸5％甲醇）12h。

1.2.5 凝膠圖像分析 凝膠通過 UMAX Power Look 2100XL掃描，凝膠數據儲存，采用 Image Master 2D Platinum 6.0軟件進行凝膠的蛋白點檢測、背景消減及匹配，配合人工校正等方法，以保證其過程的準確性。

1.2.6 質譜鑒定 切取目的蛋白質點送北京華大蛋白質組研發中心，由MALDI-TOF質譜儀進行質譜分析，獲取蛋白樣品的肽質量指紋圖，最后應用Mascot軟件在人類蛋白質公共數據庫（NCBI）中搜尋，獲得蛋白質的相關信息。

1.2.7 Western blot驗證腎臟標志蛋白表達提取小鼠腎組織總蛋白，用 Braford法檢測蛋白含量，使用 BIO RAD Mini-PROTEAN凝膠電泳儀，樣品濃度為30ug，電泳 1.5 h后取膠，用 BIO RAD轉膜儀進行濕轉。轉膜時濾紙、PVDF膜、膠的位置為：濾紙-膠-PVDF膜-濾紙；轉膜條件：14 V 10℃冰柜過夜。轉完后放入 Tris-NaCl中清洗10 min轉入5％脫脂奶粉中封閉2 h，用PBST洗滌3次，每次10 min，孵一抗室溫 2 h，取出后 PBST洗滌 3次，每次10 min，孵二抗室溫 2 h，PBST洗滌 3次，每次 10 min。然后，在 PVDF膜上加入 ECL Plus底物溶液，用 Image Quant 400凝膠成像儀測化學發光。

2 結果

2.1 雙向凝膠電泳與圖像分析結果 經Image Master 2D Platinum 6.0軟件分析，在相同條件下識別的蛋白質點個數肝組織為1484±32個，腎組織為1301±28個，血清為 318±34個，睪丸組織為1027±21個。根據3倍差異表達做為標準，共檢測出左歸飲將腎陰虛模型組非正常表達的蛋白質調節糾正為正常表達的蛋白質點為23個，圖1為各組織蛋白質表達圖譜，圖2為肝組織中異常表達蛋白質各組比較。

2.2 差異蛋白點質譜鑒定結果

對24個差異蛋白質點進行酶解、質譜分析得到PMF圖譜后，查詢 NCBInr 20100928數據庫，其中4個點由于數據搜索蛋白的分數不具有統計學意義而未得到鑒定，因此20個蛋白質點得到鑒定（結果如表1）。圖3為5號差異蛋白質點的肽質量指紋圖譜，檢索 NCBInr20100928數據庫顯示為apolipoprotein A-I，圖4為5號差異蛋白質點的分數直方圖，直方圖顯示5號蛋白質 apolipoprotein A-I的得分為93分。

圖1 各組織蛋白質表達圖譜

2.3 Western blot驗證肝臟 Arginase-1蛋白和腎臟 Aminoacylase蛋白表達結果

Arginase-1蛋白在各組小鼠中均有表達，在老年腎虛模型組表達水平較低，明顯低于青年正常對照組和左歸飲組，說明老年腎虛證小鼠體內Arginase-1蛋白表達較低，經左歸飲調節后其表達恢復正常，這與凝膠分析和質譜分析結果相符（圖5）。Aminoacylase蛋白在各組小鼠中均有表達，在老年腎虛模型組表達水平較低，明顯低于青年正常對照組和左歸飲組，說明老年腎虛證小鼠體內Arginase-1蛋白表達較低，經左歸飲調節后其表達恢復正常，這與凝膠分析和質譜分析結果相符（圖6）

圖2 左歸飲將腎陰虛模型組肝組織中非正常表達的蛋白質調節糾正為正常表達的蛋白質點

表1 腎陰虛證小鼠蛋白質鑒定結果及其表達變化情況

圖3 5號差異蛋白質apolipoprotein A-I的肽質量指紋圖譜

圖4 5號差異蛋白質apolipoprotein A-I的分數直方圖

圖5 各組Arginase-1蛋白的表達

3 討論

方證相應學說是對方劑與證候兩者間關系的一種闡述。方證相應指的是一個方劑的功效和方劑內的藥味及其配伍與其所對應的證之間存在著高度的統一性和針對性［1］。方證相應強調方與證的對應，有是證用是方，方為證立，方隨證轉。方證相應才是有效方，不對應就是無效方。中醫經過長期的臨床實踐，逐漸認識和確立了一些典型的證候，在臨床選藥組方治療這些證候時，經長期的反復驗證，形成了一批對這些證候確有療效的經典方劑。這些方劑配伍嚴謹，指征明確，只要對證用藥，臨床療效比較肯定。這些方，后世稱之為“經方”、“古方”，這些典型的證候和對這些證候確有療效的經典方劑被認為達到了方與證的相應，是公認的有效方。在此基礎上，我們設計出了探尋證候物質基礎的新方法：將某一方劑在治療相應證候的患者或動物模型時所調節糾正的那些物質視為該證候的物質基礎。因為正是該方劑在機體內發揮其藥理作用的過程中調節糾正了這些物質后，才使該證候的臨床 癥狀得以緩解或消失。如果能找出這些物質也就是找到了證的物質基礎。

圖6 各組Aminoacylase蛋白的表達

腎虛證是中醫典型的證候，中醫認為老年生理性腎虛動物模型一般屬腎陰、陽兩虛型，出自《景岳全書》的左歸飲和右歸飲是對老年腎虛證確有療效的經典方劑，它們分別具有“滋陰補腎，填精益髓”和“溫補腎陽，填精益髓”的功效。本課題選用老年小鼠為腎虛證動物模型，選用滋補腎陰的左歸飲和溫補腎陽的右歸飲為相應方劑，對老年小鼠腎虛證動物模型進行干預。取各組動物相關的組織臟器做蛋白質雙向電泳。將青年正常組、腎虛模型組和腎虛模型給藥組動物各組織臟器的電泳圖譜進行分析與互相對比，找出兩方劑，將腎虛模型組與青年正常組表達差異的蛋白質調節糾正為青年正常組所表達的蛋白質，這些蛋白質即為腎虛證標志蛋白質。本文為左歸飲干預老年小鼠腎虛證動物模型的實驗結果，其調節糾正的蛋白質應為腎陰虛證的標志蛋白質。

實驗結果表明，腎陰虛證的標志蛋白質主要有分子伴侶蛋白、參與物質代謝的蛋白質、細胞骨架、高密度脂蛋白、未知蛋白質等。

HSP70是熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）家族中的重要一員，是生物細胞中含量最高，誘導性最強熱休克蛋白。HSP70提高細胞對應激源的耐受性。HSP70通過分子伴侶作用，可與細胞內變性蛋白質結合，促進變性蛋白質的修復、降解和清除。HSP70可抑制熱休克、腫瘤壞死因子 α（TNF-α）、單核細胞、氧化應激等誘導的細胞凋亡［2］。阻斷或抑制 HSP70可誘導細胞凋亡，而HSP70的高表達則能抑制細胞凋亡［3，4］。HSP70 具有抗氧化作用，被譽為“細胞內具有抗氧化能力的急性期蛋白”［5］。HSP70 可抑制白細胞介素-1（IL-1）、TNF-α等炎癥介質的表達，抑制細胞因子介導的炎性反應，起到非特異性免疫保護作用［6-7］。此外，HSP70在抗感染免疫、腫瘤免疫、自身免疫中也具有重要作用。本次研究結果顯示，腎陰虛證小鼠組織中HSP70顯著升高，可能是腎陰虛證狀態下，各種刺激引起機體的應激反應，從而出現 HSP70高表達，以提高機體的應激耐受能力。而且，在孫曉敏等［8］的關于腎陰虛證研究中發現了HSP27異常表達，HSP70與HSP27都屬于熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）家族，這也說明熱休克蛋白與腎陰虛證的發生、發展具有密切關系。

值得注意的是，本次研究發現的參與物質代謝的蛋白質，有2個蛋白質和我們另一個研究結果相同［9］。其中一個蛋白是 Eno1，Eno1是糖酵解中ATP合成的關鍵酶，能促使 α-磷酸甘油酸脫水向磷酸烯醇式丙酮酸的轉化，同時也在糖異生過程中催化逆向反應［10］。Eno1存在于大多數組織內，是糖酵解過程的限速酶，它在腎陰虛模型動物體內的表達量增加能引起糖酵解和糖異生的增多，說明腎陰虛證動物糖代謝增強，這符合中醫陰虛生內熱的理論。

另一個蛋白是氨甲酰磷酸合成酶1（carbamoylphosphate synthetase 1），氨甲酰磷酸合成酶是尿素合成的限速酶，通過水解一分子 ATP的2個高能磷酸鍵，氨甲酰磷酸合成酶催化 NH4+與 HCO3-活化并縮合形成氨甲酰磷酸，之后其進入到鳥氨酸循環最終形成尿素。因此，氨甲酰磷酸合成酶 1表達量的減少能減慢鳥氨酸循環，由此可見腎陰虛動物氨基酸代謝減慢，說明此時蛋白質分解代謝降低。

Ezrin是 ERM（ezrin radixin moesin）細胞骨架連接蛋白家族的一員［11］。ERM家族最初被認為僅僅是連接細胞膜蛋白和胞內肌動蛋白的結構，最近發現其參與了許多細胞的生理功能［12］。ERM家族蛋白參與細胞膜表面特殊結構的組成，并且協助某些小分子物質錨定在特定的部位［13］。Ezrin是細胞表面結構的組成部分，參與了細胞與胞外基質的黏附、細胞間的相互作用、受體酪氨酸激酶和 Rho GTPase的信號傳導以及 Akt介導的細胞凋亡作用等［14、15］。

載脂蛋白 A-I（apolipoproteinA-I，ApoA-I）是高密度脂蛋白（HDL）的主要結構蛋白，約占HDL總蛋白含量的70％。ApoaA-l的主要功能是抗動脈粥樣硬化作用。在脂蛋白的代謝過程中，ApoA-l維持脂蛋白的結構和作為HDL受體的配體，還作為激活卵磷脂膽固醇?；D移酶（LCAT）的重要輔助因子，激活LCAT的活性，參與膽固醇的酯化。ApoA-l在膽固醇逆轉運（reverse cholesterol transport，RCT）過程中起關鍵作用，促進組織細胞內膽固醇的清除，避免膽固醇在外周組織中沉積［16-19］。同時，研究發現了載脂蛋白 A I與機體非特異性免疫功能相關的新功能：抗內毒素（endotxin）、調節急性相反應（acute phase response，APR）中的中性粒細胞功能以及抗病毒［20-22］。

研究結果顯示，腎陰虛證的標志蛋白質還有結合蛋白，如硒結合蛋白和維生素結合蛋白。

硒結合蛋白（Selenium binding protein l，SBP-1）主要是和硒結合，而執行調節人體免疫、抗腫瘤、抗氧化等許多重要的生理功能［23］。維生素 D結合蛋白（vitamin D binding protein，DBP）是一種可以增強中性粒細胞趨化活性、活化巨噬細胞的血清蛋白，并參與炎癥過程［24、25］。維生素D結合蛋白（vilamin D-bjnding prolein））主要合成于肝臟，是屬于白蛋白超家族中的一種結合蛋白［26］，其除了作為維生素 D在體內的蛋白結合物和載體，它還具有肌動蛋白清除功能、參與組織感染及損傷的應答機制，加強補體C5a介導的趨化活性等。

綜上所述，本實驗以方證相應學說為依據，應用蛋白質組學研究技術，找到并鑒定了1組腎陰虛證標志蛋白質，證明用此方法探尋腎虛證的標志蛋白質是可行的。本文根據這些蛋白質的功能，初步探討了腎陰虛證的發生機理，至于這些標志蛋白質與腎陰虛證發生機制之間更深的關系，還有待進一步研究。

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