神經干細胞移植對大鼠腦缺血損傷的影響及清熱化瘀方的干預*

胡躍強，唐 農，雷龍鳴，祝美珍，畢方方，胡玉英，陳 煒

（1.廣西中醫學院第一附屬醫院神經內科，南寧 530023；2.廣西中醫學院經典中醫研究所，

南寧 530001；3.中南大學湘雅醫院神經內科，長沙 410008）

腦缺血所造成的神經功能缺失一直為臨床治療的難點，中樞神經系統神經元不可再生的觀念被打破后，腦缺血后神經干細胞（NSCs）的移植、分化方面的研究成為當今神經科學領域研究的熱點，這也為NSCs移植治療腦缺血損傷提供了可能。本研究通過觀察鼠NSCs移植治療腦缺血大鼠的效果及清熱化瘀方的影響，探討該方的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與耗材 DMEM/F12干粉培養基、B27、堿性成纖維生長因子（bFGF）、表皮生長因子（EGF）、5-溴脫氧尿苷（BrdU）均為 Sigma公司產品；小鼠抗 BrdU單克隆抗體（Chemicon，USA）及兔抗nestin單克隆抗體（Pharmingen公司）；兔抗神經絲蛋白200（NF200）多克隆抗體（Santa Cruz，USA）；熒光素Cy3標記的兔抗IgG和FITC標記的羊抗IgG（北京中山）。

1.1.2 藥物 清熱化瘀方由水牛角30g、丹參15g、赤芍 15g、地龍 10g、石菖蒲 10g等中藥組成，單味中藥濃縮顆粒劑由江蘇省江陰市江陰天江藥業有限公司生產。

1.2 方法

1.2.1 NSCs的培養 取新生3d SD大鼠，用75％酒精浸泡30min后斷頭處死取出大腦，分離海馬，機械分離組織成單細胞，細胞以105/ml種入平皿，培養基用 DMEM/F12加 B27、bFGF（20ng/ml）和EGF（20ng/ml），2d更換半量培養基，10d左右用機械消化法進行傳代。將誘導擴增后的NSCs以105/ml種于0.1％明膠包埋的平皿中，放入含 5％CO2的培養箱中37℃常規培養。

1.2.2 動物分組及處理 SD大鼠100只，重200g～250g，隨機分為假手術組（A組）、模型組（B組）、干細胞移植組（C組）、干細胞移植 +清熱化瘀組（D組），每組25只大鼠，各組按處死時間分為術后第 2、4、7、14、28天 5個亞組，每個亞組 5只動物。A組：線栓只插入頸內動脈9mm；B組：動物造模后2h灌胃同清熱化瘀組等體積的蒸餾水，并給予側腦室注射等量生理鹽水；C組：大鼠在模型制作成功24h后進行 NSCs移植；D組：動物造模后，清熱化瘀湯14g/（kg·d）灌胃（按體表面積計算為臨床70kg成人劑量的3倍），各組動物均在術前6h灌胃1次，在手術清醒后開始灌胃，每天 1次，每次 1.4m1/100g大鼠，余同 C組。

1.2.3 動物造模 參照 Longa＇s線栓法阻斷左側大腦中動脈（MCAO）制備局灶性腦缺血模型。

1.2.4 NSCs移植 大鼠在腦缺血模型制作成功24h后進行NSCs移植。移植前NSCs經 Brdu（濃度5μmol/l）標記 2d，離心后將其溶解于生理鹽水中，細胞濃度調整為 6×105/ml。參照文獻方法［1］，將大鼠麻醉、固定，缺血側側腦室處（前囟左側旁1.5mm，前囟后 1.0mm）頭皮針垂直進針，在進入5.6 mm后各緩慢推入 10μl細胞懸液，留針 10min后緩慢拔針。

1.3 神經功能缺損評分（NSS）

參照 Chen 等［2］方法，分別于移植后第 2、4、7、14、28天對大鼠進行 NSS，主要觀察其運動、感覺功能、平衡能力及生理反射能力；總分為18分，正常為0分，分值越高示其神經損害程度越嚴重。

1.4 組織處理

將大鼠常規麻醉后，經左心室先后用生理鹽水和4％的多聚甲醛進行灌注。然后取腦組織固定、脫水、石蠟包埋，按4μm厚度連續切片。

1.5 神經干細胞增殖檢測

采用免疫組化ABC法。石蠟切片以1％H2O2滅活內源性過氧化物酶，滴加正常山羊血清封閉液室溫下孵育 30min，接著分別滴加 1∶100稀釋的小鼠抗nestin單克隆抗體和兔抗 BrdU單克隆抗體，4℃過夜，然后以 PBS洗滌。再滴加 1∶100的二抗生物素化兔 IgG，PBS沖洗。陰性對照用正常羊血清代替一抗。

1.6 新生神經元檢測

采用熒光雙標免疫組化法檢測BrdU和NF200表達雙陽性細胞為新生神經元，小鼠抗 BrdU抗體（1∶100）以 Cy3標記，兔抗 NF200抗體以 FITC標記。被標記新生神經細胞同時發出紅色（Cy3）核染區和綠色（FITC）胞漿染色區。

1.7 細胞圖像分析

用計算機圖像分析系統計數腦梗死后不同時間段陽性細胞數。每個動物隨機選取相同位置的6張腦片，每張腦片在大鼠腦缺血半暗帶隨機選取6個視野（×400），計算每個視野的免疫陽性細胞（BrdU、Nestin、BrdU/NF200）數目的平均值。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 大鼠NSS的比較

表1顯示，大鼠造模后出現不同程度的神經功能缺損，其癥狀隨缺血時間的延長而逐漸減輕；NSCs組移植后第2、4、7天 NSS與模型組比較差異均無顯著性（P＞0.05），但第 14、28天其 NSS均顯著低于模型組（P＜0.05）；而 NSCS移植 +清熱化瘀組則在第7、14、28天的 NSS顯著優于模型組（P＜0.05）。

表1 大鼠 NSS的變化±s）

表1 大鼠 NSS的變化±s）

注：與 B組比較：*P＜0.05

NSS組別2d 4d 7d 14d 28d B組7.8±1.7 7.2±1.6 6.9±1.6 6.6±1.5 6.0±1.2 C組 7.5±1.5 7.0±1.4 6.4±1.2 5.5±1.1* 4.8±1.0*D組 7.3±1.4 6.7±1.3 5.8±1.1* 5.0±1.0* 4.0±0.8*

2.2 大鼠缺血腦損傷后NSCs增殖的比較

模型組大鼠腦缺血損傷后可以檢測到少量的nestin陽性細胞，其表達于缺血后7d達高峰（P＜0.05），以后表達逐漸減弱；與模型組相比，NSCs組移植后 nestin表達在第 7、14、28天顯著增加；移植加中藥組在第14、28天時缺血半暗帶區 nestin陽性細胞數較單純移植組顯著增加（P＜0.01，P＜0.05）。模型組大鼠腦缺血損傷后未能檢測到 BrdU陽性細胞，NSCs移植后可檢測到BrdU陽性細胞，主要分布在缺血周圍區，并可見其從室旁區向缺血區移行，其表達于移植后14d達高峰（P＜0.05），以后表達逐漸減弱；移植加中藥組在第14、28天時缺血半暗帶區BrdU陽性細胞數較單純移植組顯著增加（P ＜0.05）（見表 2、3圖① ～ ④）。

表2 各組大鼠 nestin蛋白陽性細胞數比較±s，n=5）

表2 各組大鼠 nestin蛋白陽性細胞數比較±s，n=5）

注：與 B組比較：*P＜0.05，＊＊P＜0.01；與 C 組比較：△P ＜0.05；與組內其他時間點比較：#P＜0.05

組別 時相2d 4d 7d 14d 28d A組00000 B組 4.22±1.46 8.89±1.63 13.78±2.15# 9.20±1.78 7.67±1.60 C組 5.03±1.34 10.65±1.93 20.32±2.45#＊＊15.24±2.21＊＊ 11.56±2.02*D組 6.12±1.27 12.29±1.98 22.25±2.73 18.79±2.67△ 15.25±2.36△

表3 各組大鼠 BrdU陽性細胞數比較±s，n=5）

表3 各組大鼠 BrdU陽性細胞數比較±s，n=5）

注：與 C組比較：△P＜0.05；與組內其他時間點比較：*P＜0.05

組別 時相2d 4d 7d 14d 28d A組00000 B組 0 0 0 0 0 C組 16.23±2.65 25.74±3.21 33.26±4.76* 48.55±6.32* 30.58±5.24 D組 18.36±2.87 29.13±3.36 40.05±5.50 60.49±6.68△ 47.66±5.87△

2.3 新生神經元比較

NSCs移植后 7d可見，少量的 BrdU/NF200雙陽性細胞出現在缺血周圍處，其表達隨缺血時間延長而逐漸增加；移植加中藥組在第14、28天時缺血半暗帶區BrdU/NF200雙陽性細胞數較單純移植組顯著增加（P＜0.05）（見表4和圖⑤⑥）。

3 討論

NSCs是中樞神經系統中具有自我更新能力和多種分化潛能的細胞，雖然終身存在，但由于其絕對數量和局部微環境所限，致使中樞神經系統損傷或變性時，自我修復作用微乎其微。因此，采用外源性干細胞移植成為近年來治療中樞神經損傷的熱點研究領域，也同樣為腦缺血損傷的治療提供了新的思路。

表4 各組大鼠BrdU/NF200陽性細胞數比較± s，n=5）

表4 各組大鼠BrdU/NF200陽性細胞數比較± s，n=5）

注：與 C組比較：*P＜0.05

組別 時相2d 4d 7d 14d 28d B組0 0 0 0 0 C組 0 3.61±0.92 6.73±1.20 19.54±2.24 26.82±3.16 D組 0 5.24±1.08 9.24±1.33 31.60±3.57* 39.75±4.28*

①②:缺血7天C組和D組頂葉皮質nestin蛋白表達(×400);③、④:缺血28天C組和D組頂葉皮質BrdU陽性細胞表達(×400);⑤⑥:缺血14天C組和D組頂葉皮質BrdU/NF200雙陽性細胞表達(免疫熒光 ×400)

已有研究證實，NSCs移植能夠促進局灶性腦缺血大鼠神經功能的恢復。如Park將NSCs注入缺血鼠腦中，NSCs可接合入變性的 CNS中，可優先移入缺血區，并增殖分化為神經元［3］。Shen等將 NSCs注入鼠腦缺血損傷區，可縮小缺血后腦梗死面積，改善神經功能［4］。最近也有聯合移植的相關報道，如Yu等將NSCs和I型膠原聯合移植治療腦缺血，能夠顯著促進損傷腦組織結構和功能的恢復［5］。中藥作為體內微環境的調節劑，可能在減少神經干細胞移植后的副反應，促進其分化和遷移等方面具有重要的作用，國內在這方面也開始了有益的嘗試［6］，顯示出較大潛力。但聯合應用中藥復方和NSCs治療腦缺血的報道甚少，值得進一步探討。

“毒損腦絡”學說是中醫中風認識上的新理論，認為中風發病是由于毒邪損傷腦絡、絡脈破損或絡脈拘攣瘀閉、氣血滲灌失常所致［7］。結合腦缺血損傷后 NSCs的變化，我們認為腦缺血急性期產生的痰瘀熱毒混雜腦內，損傷腦髓及腦絡，NSCs的增殖分化遷移之源受到抑制、破壞，導致神經功能缺損及功能恢復受限。因此我們認為，解毒通絡是治療大法［8］，據此理論而設的清熱化瘀方，其功能為清熱解毒化痰、活血化瘀通絡，是治療腦梗死的有效方劑。一系列研究表明，其通過不同途徑對腦缺血損傷組織具有保護作用，作為腦神經功能保護劑在臨床運用方面有較好的療效［9～11］。

本研究發現，大鼠腦缺血損傷可以誘導少量nestin的表達，且在缺血后 7d時表達呈高峰；經BrdU標記的NSCs側腦室移植后2d即可見BrdU蛋白陽性細胞，主要分布在缺血周圍區，并可見其從室旁區向缺血區移行，其表達于移植后14d達到高峰，說明移植的 NSCs能夠在宿主腦內存活；免疫熒光顯示，NSCs移植后 7d可見 BrdU/NF200雙陽性細胞出現在缺血周圍處，其表達隨缺血時間延長而逐漸增加，說明移植的 NSCs能夠分化為新生神經元，也提示移植NSCs對腦缺血大鼠的神經功能恢復起到了積極作用；移植加中藥組可顯著增加缺血后第14、28天時缺血半暗帶區 nestin、BrdU和 BrdU/NF200陽性蛋白表達，說明清熱化瘀方可促進 NSCs增殖為神經元并促進其遷移，從而發揮腦保護作用，這為其早期給藥治療提供了實驗基礎。

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