鹽度突變對半滑舌鰨血漿滲透壓和鰓絲Na+/K+-ATP酶活性的影響

田相利, 王國棟 董雙林 房景輝 劉 營

（1. 中國海洋大學 水產學院 教育部海水養殖重點實驗室, 山東 青島 266003; 2. 盤錦光合水產有限公司,遼寧 盤錦, 124200）

鹽度突變對半滑舌鰨血漿滲透壓和鰓絲Na+/K+-ATP酶活性的影響

田相利1,2, 王國棟1, 董雙林1, 房景輝1, 劉 營1

（1. 中國海洋大學 水產學院 教育部海水養殖重點實驗室, 山東 青島 266003; 2. 盤錦光合水產有限公司,遼寧 盤錦, 124200）

研究了半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）由鹽度30突變至0、10、20、35和40鹽度后血漿滲透壓和鰓絲Na+/K+-ATP酶活性的變化。結果表明, 鹽度對半滑舌鰨血液滲透壓和鰓絲Na+/K+-ATP酶活性均有顯著影響（P＜0.05）。鹽度突變后, 各處理組的血液滲透壓和鰓絲Na+/K+-ATP酶活性均隨鹽度的變化而相應地上升和下降, 且其變化幅度與鹽度的變化幅度直接相關。各處理組血液滲透壓在經歷鹽度變化6 d內有峰值變化, 峰值出現在2 d時, 6 d后血液滲透壓趨于穩定; 而鰓絲Na+/K+-ATP酶活性在經歷鹽度變化9 d時調節至穩定狀態, 峰值則出現在6 d時, 峰值大小亦與鹽度的變化幅度正相關。本研究表明半滑舌鰨對鹽度可能具有較強的適應能力。

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）;鹽度; 血液滲透壓; 鰓絲Na+/K+-ATP酶活性

生活在淡水或海水中的各種硬骨魚類, 其體液滲透濃度比較接近且相對穩定, 而其生活的水環境鹽度卻相差很大, 魚類為了維持體內一定的滲透濃度必須進行滲透調節, 這樣, 魚類調節滲透能力的大小就決定了它們對水環境鹽度變化的耐受力。不同魚類對于鹽度變化的耐受力差異很大:大菱鲆（Scophthalmus maximus）可以忍受較大而快速的環境鹽度波動, 但其適應的鹽度低限在鹽度5左右[1], 而潘魯青等[2]的研究則表明褐牙鲆（Paralichthys olivaceu）對最低鹽度為 6的低滲環境具有較強的適應能力。目前, 國內外對魚類的滲透調節研究已有許多相關報道, 這些研究中, 大多以血漿滲透壓和鰓絲Na+/K+-ATP酶作為評價魚類滲透調節能力的指標[1-6]。半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）為中國近海常見的暖溫性底棲大型魚類[7], 主要分布在中國黃海和渤海。半滑舌鰨個體大, 生長速度快, 肉味鮮美, 是一種名貴經濟海水魚類, 由于該魚具有廣溫、廣鹽等特點, 因此是一種理想的增養殖種類。目前, 盡管國已內有半滑舌鰨低鹽度養殖的實踐, 但國內外關于其滲透調節的研究尚未見報道。本研究設定了不同的突變鹽度水平, 通過測定半滑舌鰨幼魚的血液滲透壓和鰓絲 Na+/K+-ATP酶活性, 對其滲透調節能力進行了研究, 初步探討了半滑舌鰨對鹽度的適應性, 從而可為其在不同鹽度下的養殖生產實踐提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗魚的來源

實驗用半滑舌鰨幼魚購自江蘇省海洋水產研究所, 體質量 12.67 g±2.87 g, 全長 13.52 cm±1.65 cm,均為健康個體。

1.2 實驗魚的馴化

實驗魚運到后, 在室內24℃±0.5 ℃馴養10 d左右, 使之適應實驗室的條件。馴養期間每天于 7:00和17:00各投喂1次, 日換水率50%。

1.3 實驗設計與管理

1.3.1 實驗設計

本實驗設置了 6個不同鹽度突變水平, 將馴養的半滑舌鰨幼魚按照隨機抽取的方式, 由鹽度30（以S30表示）分別突變到 0、10、20、35和 40（分別以S0、S10、S20、S35和S40表示）, 每個處理分別設置3個重復。實驗過程中, 按照時間0、1、6、12 h、1、2、3、6、9和12 d的時間間隔取樣, 每次每個處理隨機取魚3尾。

1.3.2 實驗管理

實驗用水族箱為玻璃水族箱（規格為 55 cm×30 cm×35 cm, 50 L）, 每箱隨機放魚30尾, 水族箱用紗窗蓋住, 防止魚跳出。實驗期間保持正常換水, 換水前一天調至適宜的鹽度。低鹽度水由經過充分曝氣的砂濾海水（鹽度 30）和井淡水（鹽度為 0）調配而成,高鹽度水由砂濾海水加海水素調配而成。

每天7:00和17:00各投喂一次日清紅丸配合飼料, 其營養成分見表1。每次投喂1.5 h后, 將殘餌和糞便吸出。實驗期間, 水溫控制在24℃左右, 光照周期為12 L:12 D, 24 h時連續充氣。

1.4 血漿的取樣和滲透壓的測定

用1 mL注射器從半滑舌鰨腹部尾靜脈插入抽取血液, 血液抽出后置于冷的 1.5 mL離心管中, 立即取20 μL用FISKE 210型冰點滲透壓計測定滲透壓。滲透壓用滲透濃度（即溶解顆粒數表示的濃度）來表示, 單位為mmol/kg。

1.5 鰓絲Na+/K+-ATP酶活性的測定

酶液的制備: 取魚兩側鰓絲, 用預冷蒸餾水（0～4℃）洗凈、濾紙吸干后置于10 mL冰冷酶提取液（0.25 mmol/L蔗糖, 6 mmol/LEDTA-Na2, 10 mmol/L tris, 0.1%脫氧膽酸鈉, pH為7.5）中, 用高速勻漿器在冰水浴中以20 000 r/min轉速勻漿5 min, 勻漿液在高速冷凍離心機（0～1℃, 10 000 r/min）中離心30 min,取上清液再離心 10 min, 將所得上清液冷藏（0～2℃）保存, 在8 h內測定Na+/K+-ATP酶活力。

酶蛋白含量采用考馬斯亮藍法測定。Na+/K+-ATP酶活力測定參考Whealty等[8]的方法, 通過測定全酶反應體系和Na+/K+-ATP酶活力被抑制反應體系中底物 ATP-Na2釋放出無機磷（Pi）量的差值來計算,酶活力單位采用mmol/（g·h）表示。

1.6 數據處理與分析

所得數據用統計軟件SPSS13.0進行分析, 不同處理組間使用單因素方差分析和Duncan多重比較進行分析, 以P＜0. 05作為差異顯著性水平。

表1 飼料的含能量及營養組成Tab. 1 Energy content and composition of the experimental diet

2 結果

2.1 不同鹽度下半滑舌鰨血液的滲透壓變動

鹽度對半滑舌鰨血液滲透壓的影響情況見圖 1,鹽度突變對半滑舌鰨的血液滲透壓有顯著影響（P＜0.05）。鹽度變化后, 高鹽處理組下半滑舌鰨血液滲透壓顯著升高, 低鹽處理組的則明顯降低, 且變化幅度隨鹽度突變范圍的增大而增大, 在6 d內有峰值變化, 峰值出現在2 d左右。6 d后各處理組半滑舌鰨血液滲透壓趨于穩定。實驗結束時, 不同鹽度下半滑舌鰨血漿滲透壓數值呈現出 3個不同的水平,即鹽度35和40, 20和30以及0和10, 其數值相互之間差異顯著（P＜0.05）, 鹽度為35和40時其酶活性最高, 鹽度為0和10時其酶活性最低。

圖1 鹽度對半滑舌鰨血液滲透壓的影響Fig. 1 The effect of salinity on the plasma osmotic pressure ofCynoglossus.semiliaevis

2.2 不同鹽度下半滑舌鰨鰓絲Na+/K+-ATP酶的活性變動

由圖 2可見, 鹽度對半滑舌鰨鰓絲 Na+/K+-ATP酶活性有顯著影響（P＜0.05）, 鰓絲 Na+/K+-ATP酶活性隨鹽度的升高和降低而相應的升高和降低, 且變化幅度總體上隨鹽度變化范圍的增大而增大。鹽度突變9 d內, 各處理組鰓絲Na+/K+-ATP酶活性出現峰值變化, 且高鹽處理組和低鹽處理組的鰓絲Na+/K+-ATP酶活性在6 d左右時分別出現最大值和最小值, 在9 d之后各處理組半滑舌鰨鰓絲Na+/K+-ATP酶活性趨于穩定。實驗結束時, 不同鹽度下半滑舌鰨鰓絲Na+/K+-ATP酶活性也呈現出3個不同的水平, 即鹽度35和40, 10、20和30以及0, 其數值相互之間差異顯著（P＜0.05）, 鹽度為35和40時其酶活性最高, 鹽度為0時其酶活性則最低。

圖2 鹽度對半滑舌鰨鰓絲Na+/ K+-ATP酶活性的影響Fig. 2 The effect of salinity on gill Na+/ K+-ATPase activity ofCynoglossus semiliaevis

3 討論

3.1 鹽度對半滑舌鰨血液滲透壓的影響

為了維持體液離子濃度和滲透壓平衡, 魚類形成了較高級的滲透壓調節機制, 滲透壓調節主要由鰓、腎和腸對離子和水的轉運來完成。在低鹽度水體中, 環境滲透壓低于魚體的體液滲透壓, 魚會被動吸收過多的水分并丟失離子, 此時魚類通過排出低滲尿和增加鰓對離子的攝入來維持體液滲透平衡。而在高鹽度水體中, 環境滲透壓高于體液滲透壓,魚會通過體表和鰓被動丟失水分, 此時魚會通過吞食高鹽水, 在保存水分的同時, 由鰓排除被動攝入的過多 Na+和 Cl-離子, 腎排除 Mg2+、SO42-、Ca2+離子和少量水分, 從而維持體液的滲透平衡[6,9-10]。在魚類對鹽度的適應過程中, 一般分為兩個階段:一是鹽度變化后短期內, 魚類的血漿滲透壓與鹽度正相關地迅速升高或降低, 這一變化隨即刺激魚體滲透調節生理機制的改變; 二是滲透壓向變化前狀態的恢復的過程。但魚類滲透壓變化的程度和恢復所需要的時間受種間差異、鹽度變化范圍的大小以等多種因素的影響差異較大。如墨西哥灣鱘（Acipenser oxyrinchus）[11], 由淡水向鹽度25突變后24 h即開始滲透壓的恢復, 96 h后基本達到穩定狀態; 將黑棘鯛（Acanthopasgrus butcheri）[12]由鹽度 36變化至 12、24、48、60后3個月, 鹽度12、24、48組即處于穩定狀態, 而鹽度為6處理組在6個月時才恢復。而褐牙鲆幼魚由鹽度30向24、18、12、6適應時, 6 d后血漿滲透壓達到穩定狀態[2]。本實驗結果則顯示, 鹽度突變后2 d內, 半滑舌鰨血液滲透壓隨鹽度的升高和降低而迅速的相應升高和降低, 這可能是其對水環境鹽度的被動適應, 之后魚體自身生理機制的作用下,血液滲透壓逐漸恢復, 到6 d左右時則趨于穩定。這一結果說明半滑舌鰨對鹽度有較強的適應能力, 在很大范圍的鹽度突變后仍能調節機體適應外界水環境。

真骨魚類能夠調節體內液體環境的離子濃度使之維持在一個很小的范圍內[13], 廣鹽性魚類在這方面表現得尤為明顯。通常不同種類對內環境滲透壓變化范圍的要求略有不同, 但普遍符合血漿滲透壓與鹽度之間呈正相關這一關系[11-14]。本研究結果與這一規律基本相似, 半滑舌鰨血漿滲透壓最終數值呈現出3個不同的水平, 即鹽度35和40、20和30以及 0和 10。這一結果表明, 盡管半滑舌鰨可以通過機體對血液滲透壓的調節來適應外界環境的較大范圍的鹽度變化, 但其最終的調節程度還是與環境鹽度的變化范圍直接相關的。

3.2 鹽度對半滑舌鰨鰓絲 Na+/K+-ATP酶活性的影響

鰓是魚類滲透調節和離子運輸的主要器官, 鰓上皮的泌氯細胞中含有大量Na+/K+-ATP酶, 該酶的含量和活力一般隨環境鹽度變化而發生變化[15-16]。無論是淡水魚還是海水魚, Na+/K+-ATP酶都是其氯細胞離子轉運的關鍵酶[3]。在環境鹽度發生變化時,魚類鰓絲Na+/K+-ATP酶活力會升高或降低[3-5], 這種變化與鰓氯細胞的變化以及Na+/K+-ATP酶的分泌活動密切相關, 是鰓對體內外 Na+和 Cl-等離子運輸需要的適應[3-4,10,17]。本研究結果表明, 半滑舌鰨鰓絲Na+/K+-ATP酶活性也隨鹽度的變動而相應的升高和降低, 且其升降程度隨鹽度變化范圍的直接相關。鹽度突變9 d內, 各處理組鰓絲Na+/K+-ATP酶活性出現峰值變化, 且高鹽處理組和低鹽處理組的鰓絲Na+/K+-ATP酶活性在6 d左右時分別出現最大值和最小值, 在 9 d之后各處理組半滑舌鰨鰓絲Na+/K+-ATP酶活性趨于穩定。從時間進程上看, 半滑舌鰨鰓絲Na+/K+-ATP酶活性的變化滯后于血漿滲透壓的變化。這可能由于半滑舌鰨的滲透調節并不完全是由鰓絲Na+/K+-ATP酶來完成的, 可能還有其他器官對滲透壓進行調節。另外, 本研究結果發現,半滑舌鰨鰓絲Na+/K+-ATP酶活性穩定后基本與環境中鹽度水平呈正相關, 但呈現出3個不同的水平, 即鹽度35和40, 10、20和30以及0, 其數值相互之間差異顯著（P＜0.05）。其中, 以鹽度 35和 40下Na+/K+-ATP酶活性最高, 鹽度 0下則為最低, 這一點與褐牙鲆的相關研究不同[2]。褐牙鲆幼魚在適應相應的鹽度后, 其鰓絲Na+-K+-ATP酶活力在高滲環境中與外界鹽度大小呈正比, 但在低滲環境中與鹽度卻呈反比。這一現象的出現可能與不同魚類的滲透調節能力和調節方式有著不同甚至是很大的種間差異有關, 具體機制則尚待進一步深入研究。

3.3 廣鹽性魚類對環境鹽度的適應機制

當水環境中鹽度升高時, 魚類面臨的主要問題是如何將吞飲海水而吸收的過多鹽分排除體外。此時廣鹽性魚類對低滲環境的滲透壓調節機制被抑制,而對高滲環境的滲透壓調節機制被激活。廣鹽性魚類進入高滲環境后, 其大量吞飲海水所吸收的 Na+和 Cl-主要通過鰓上皮的氯細胞排出體外, 以維持體內外離子和滲透壓平衡。此時氯細胞發生一系列的細胞學變化, 如細胞數量增多, 直徑增大, 線粒體數量增加等, 同時, 也包括某些蛋白質種類的合成, 其中最重要的便是Na+/K+-ATP酶。隨著水環境中鹽度的增加, 伴有 Na+/K+-ATP酶活性的增加, 從而為廣鹽性魚類體內大量 Na+和 Cl-的排出提供所需的能量。另外, 廣鹽性魚類在海水中對 Na+和 Cl-的外排還受激素的調控。血漿中皮質醇可能是魚類對海水適應的調節劑, 它可以增加鰓 Na+的轉運和Na+/K+-ATP酶的活性[6]。

相反, 當水環境中鹽度降低時, 廣鹽性魚類對高滲環境的滲透壓調節機制受到抑制, 而對低滲環境的調節機制則被激活, 從而維持體內的較高的滲透壓。當廣鹽性魚類進入低滲環境后, Ca2+、Mg2+、SO42-等的排出迅速減少。同時, 鰓上皮排出的 Na+和Cl-亦迅速下降到較低水平。魚體的這些反應可能是由某些機體調節機理影響氯細胞排出NaCl所致。同時, 某些激素, 如生長激素能通過提高Na+/K+-ATP酶的活性和泌氯細胞的數目, 抑制血漿滲透壓和離子濃度的提高, 從而幫助魚類適應海水環境[18-19]; 而催乳激素對魚類適應低鹽度環境起關鍵作用, 它可以抑制 Na+的排出和 Na+/K+-ATP酶的活性[20]。Persson等[21]研究了成熟的大西洋鮭從海洋到江河產卵洄游過程中各階段的滲透壓調節狀況,發現河口捕獲的鮭魚鰓絲 Na+/K+-ATP酶活性不高,表明該魚已經適應了低滲環境, 而在河上游捕獲的鮭魚鰓絲Na+/K+-ATP酶活性則更低, 表明鮭魚在淡水中鰓絲滲透調節能力已經受到抑制。本研究結果表明, 半滑舌鰨通過機體的一系列生理調節后, 可以很好適應較高鹽度（40）和較低鹽度（0）, 是一種典型的廣鹽性魚類。不過, 由于本研究鹽度設置所限,關于半滑舌鰨對高鹽度耐受的上限尚待進一步研究。

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Received: Mar., 23, 2010

Key words:Cynoglossus semilaevis; salinity; plasma osmolality; gill Na+/K+-ATPase activity

Abstract:Changes in plasma osmolality and gill Na+/K+-ATPase activity of the juvenile tongue sole （Cynoglossus semilaevis） were studied by abruptly shifting the of salinity from 30 to 0, 10, 20, 35 or 40. The results showed that the effects of the salinity on plasma osmolality and activity of gill Na+/K+-ATPase of the fish were significant（P＜0.05）. The peak values of plasma osmolality appeared on day 2 after the changes of salinity, and the plasma osmolality in each group was stablized on day 6. The similar trends were observed in the changes of gill Na+/K+-ATPase activity. The peak values of gill Na+/K+-ATPase activity appeared on day 6 after the changes of salinity, and was dimished gradually to the stable leve1 at day 9. The results of this study indicated that the tongue sole might have a great capability of acclimation to different salinities.

（本文編輯:譚雪靜）

Effects of salinity on plasma osmolality and gill Na+/K+-ATPase activity of the tongue Sole （Cynoglossus semilaevis）

TIAN Xiang-li1,2, WANG Guo-dong1, DONG Shuang-lin1, FANG Jing-hui1,LIU Ying1
（1. Key Laboratory of Mariculture, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China;2. Panjin Guanghe Fisheries Company Ltd., Panjin 124200, China）

S965.215

A

1000-3096（2011）02-0027-05

2010-03-23;

2010-05-24

國家“十一五”科技支撐計劃課題項目（2006BAD09A01）;國家 863計劃項目（2006AA10Z409）; 山東省優秀中青年科學家科研獎勵基金項目（2005BS07004）; 新世紀優秀人才支持計劃項目（NCET-08-0503）

田相利（1971-）, 男, 內蒙古赤峰人, 副教授, 主要從事養

殖生態學研究, E-mail: xianglitian@ouc.edu.cn