瑤山甜茶可溶性糖的測定

鄒青松，陳 山，王 曉，陳 瑋，李素霞，韋艷君

（廣西大學糖業工程技術研究中心，廣西南寧530004）

瑤山甜茶可溶性糖的測定

鄒青松，陳 山*，王 曉，陳 瑋，李素霞，韋艷君

（廣西大學糖業工程技術研究中心，廣西南寧530004）

為探明瑤山甜茶中可溶性糖的含量和種類，采用蒽酮—硫酸比色法測定其可溶性總糖含量，運用高效凝膠過濾色譜法（HPGFC）測定多糖分子量分布范圍，并利用高效液相色譜—蒸發光散射檢測器（HPLC－ELSD）法在兩種流動相體系中測定和分析其低分子寡糖和單糖的種類與含量。結果表明，瑤山甜茶中可溶性總糖含量為15.20%，相對標準偏差（RSD）為0.996%；多糖分子量Mw范圍為51551～55628，RSD為0.64%～1.23%；單糖種類主要為木糖、果糖和葡萄糖，相對含量分別是0.54%、52.18%和42.76%。

瑤山甜茶，可溶性糖，蒽酮－硫酸法，高效凝膠過濾色譜法（HPGFC），高效液相－蒸發光散射法（HPLC－ELSD）

瑤山甜茶是多年生落葉帶刺灌木，經鑒定為薔薇科懸鉤子屬植物［1］，廣泛分布于廣西金秀、桂平、藤縣等地區，學名Rubus Suavissimus S.Lee，國外也稱之為Tien cha或Chinese sweet tea，因其葉具有強烈的甜味口感而得名，并在民間入藥用于補腎降壓，被當做一種茶而飲用已久。甜茶的主要甜味成分是甜茶甙，約占甜茶干葉重量的5%［2］，質量濃度為0.025%時其甜度是蔗糖的115倍，這使得瑤山甜茶具有優良天然甜味劑的品質［3－4］。隨著人們生活水平的提高，人口老齡化加劇以及肥胖發生率的增加，糖尿病的發病率呈逐年上升趨勢。據統計［5］，中國已確診的糖尿病患者僅城市地區就高達4000萬，城鄉人群發病率正以令人擔憂的速度遞增。這使得尋找新的非糖低能量天然甜味劑的問題亟待解決，也為瑤山甜茶提供了潛在的巨大市場。近年來研究表明，甜茶及其提取物具有抗過敏［6］、抑制糖基轉化以及防止肥胖和治療糖尿病等藥效功能，將甜茶用作食品或藥品中的重要成分已有文獻報道［7－9］。然而，甜茶的甜味物質在報道中多為甜茶甙及其衍生物，甜茶自身的糖類物質未見確切報道。本文利用蒽酮－硫酸比色法測定瑤山甜茶中可溶性總糖，采用HPGFC法測定甜茶中多糖含量以及平均分子量分布范圍，利用高效液相色譜法（HPLC－ELSD）測定瑤山甜茶中的寡糖和單糖種類和含量，為瑤山甜茶這一優良的食藥兩用資源的產品深開發提供實驗數據和依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甜茶干葉 產于廣西金秀大瑤山，經粉碎后過40目篩；葡萄糖、果糖、蔗糖 均為分析純，上海國藥集團；低聚果糖 由廣西奧立高生物有限公司提供，純度大于99%；系列葡聚糖標準品 重均分子量（Mw）范圍為5900～778，000，Sigma公司；乙腈、乙酸乙酯 均為色譜純，美國Fisher公司；其它試劑 均為國產分析純；實驗用水 超純水。

桌面超濾膜組件 安瑪西亞中國有限公司；UV－2501PC雙光束紫外可見分光光度計 日本島津公司；高效液相色譜系統 Waters－600－ELSD－2000，配Empower軟件系統，美國Waters公司；HPLC色譜柱2，大連伊利特公司；Agilent 1100高效液相色譜系統 配示差折光檢測器，Agilent GPC軟件系統，美國Agilent公司；TSK凝膠柱 日本東洋曹達公司；HPGFC色譜柱。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理［10－12］甜茶干葉經石油醚回流提取2h脫脂處理后，風干備用。稱取20g處理好的甜茶干葉置于1000mL大燒杯中，按照料液比=1∶30（w/v，g/mL）加入90℃的超純水，并把燒杯迅速置于85℃水浴鍋中，以電動攪拌機300r/min攪拌，20min后趁熱抽濾，重復浸提一次。提取液經活性炭顆粒（2%添加量，70℃水浴搖床，60r/min，30min）脫色，抽濾后得到濾液，取250mL濃縮至約50mL時用四倍的無水乙醇做醇沉處理，置于冰箱4℃冷藏室過夜，離心所得沉淀物采用真空冷凍干燥法凍干，得甜茶糖類粉末TPS1。剩余濾液采用截留分子量為10萬（MWCO 100kDa）的超濾膜去除蛋白質等大分子物質和進一步脫色，透過液經真空旋轉蒸發濃縮后，同樣進行醇沉和真空冷凍干燥處理，得到TPS2。

1.2.2 蒽酮－硫酸法測定總糖條件［13］準確稱取經石油醚處理過的干葉5g，置于250mL具塞三角瓶中，加沸水50mL，加蓋超聲提取10min后再進行85℃水浴提取10min，趁熱抽濾，濾液冷卻后定容與100mL容量瓶中，得提取液。參照文獻［13］，以葡萄糖為對照觀測指標，采用紫外分光光度法在波長為620nm處測定甜茶可溶性總糖。

1.2.3 HPGFC色譜條件［14］色譜柱：TSK4000PW凝膠柱（7.5×300mm），TSK－3000SW 凝膠柱（7.5×300mm），TSK－Guard SW（7.5×75 mm）保護柱；柱溫：23℃；柱壓：0.262MPa；流動相為超純水，超聲脫氣后備用；流速0.8mL/min；進樣量：20!L。

精密稱取系列葡聚糖標準品，用超純水定容于5mL容量瓶，得到10.0mg/mL的標準品溶液；另分別配制此濃度的TPS1和TPS2溶液。所配溶液先經10000r/min高速離心5min，再取上清液經0.45!m的濾膜過濾后進樣測定。

1.2.4 HPLC色譜條件［15－18］色譜柱：Hypersil ODS NH2（250mm×4.6mm i.d.，5!m），流動相流速：1.0mL/min；ELSD－2000條件：漂移管溫度100℃，氮氣做載氣，載氣流速為 2.5L/min。以超純水配制4.0mg/mL的TPS1用于HPLC－ELSD測定，對照品糖液濃度為1mg/mL，所配溶液先經10000r/min高速離心5min，再取上清液經0.45!m的濾膜過濾后進樣測定。

流動相體系1：參照文獻［15］和［16］，并通過預實驗摸索，選定流動相體系1為乙腈/乙酸乙酯/水=65/25/10（v/v/v），進樣量為15!L。

流動相體系2：參照文獻［17］和［18］，并通過預實驗摸索，選定流動相2為乙腈/水=75/25（v/v），進樣量為5!L。

2 結果與分析

2.1 總糖測定

蒽酮－硫酸比色法的原理是糖類在高溫下被濃硫酸水解成單糖并迅速衍生成糠醛或羥甲基糖醛后，再與蒽酮結合成藍綠色化合物，該物質在620nm處有最大紫外吸收峰，并在150!g/mL范圍內，其顏色深淺與可溶性糖成正比。而且該法快速方便，在無需細分糖類的情況下，可以一次性測出總量，故本工作采用此法測定瑤山甜茶中總的可溶性糖。測定結果顯示，葡萄糖標準曲線為y=0.007x+0.008（R=0.9978），線性范圍是0～100!g/mL，參照此標準曲線，結合試樣的吸光值得到瑤山甜茶總可溶性糖為15.20%，其RSD為0.996%（n=3）。

2.2 HPGFC測定多糖分子量

HPGFC（高效凝膠滲透色譜）是高效液相色譜這一大類中體積排阻色譜法（SEC）的一種，是使用水溶液的凝膠過濾色譜法。HPGFC以分子篩為原理，不同分子量的物質通過凝膠柱時，小分子量物質被吸附從而延后被洗出，大分子物質則率先被洗出［19］。

選用藍色葡聚糖，作為測試大分子多糖保留時間t0的對照物，選用葡萄糖作為測試小分子糖保留時間tT的對照物，樣品的保留時間為tR，若tR居于t0和tT之間，則表明樣品在選用的流動相的HPGFC系統中均為選擇性滲透，選用的色譜柱系統無誤［20］。結果測得t0為12.773min，tT為29.952min，所測葡聚糖標準品以及樣品的保留時間都在這個范圍之內，表明選用的色譜系統和測定條件合適。

在1.2.3實驗條件下，Mw在5900～112000之間的葡聚糖的洗脫體積（Ve）和相對分子質量對數值（lgMw）線性關系良好，擬合曲線方程為 lgMw=－0.124Ve+7.076（r=0.9950），如圖1所示。每一個樣品分別進樣三次，分析樣品的洗脫體積，確定5900～112000間的擬合曲線可以作為對照標準曲線。利用GPC軟件進行分析，對照標準曲線，可知TPS1中多糖的Mw為55628，TPS2為51551，RSD為0.64%～1.23%。利用origin 8軟件對色譜圖進行擬合分析，發現HPGFC測定數據呈較好的正態分布。

圖1 葡聚糖分子量對數值與保留時間對應關系

圖2 廣西甜茶糖類物質HPGFC色譜圖

2.3 HPLC分析瑤山甜茶小分子糖類

表1 HPLC－ELSD測定各種糖的色譜圖的分析報告

趙仁邦［15］等確定了乙腈/乙酸乙酯/水=60/25/15（v/v/v）的流動相體系在HPLC－ELSD法中能夠很好地分離出棗的木糖、葡萄糖和果糖等單糖，同時可以分離出蔗糖；閆建榮［11］等利用乙腈/水 =70/30（v/v）體系在HPLC－ELSD法同時檢測到云南甜茶中葡萄糖、蔗糖等8種單糖和二糖。

許秀敏［17］等在流動相為乙腈/水=75/25（v/v）的條件下采用HPLC-ELSD法較好地分離了低聚果糖的 1～5糖，Mabel M J［13］等則采用液質聯用（LC－MS）法探明了低聚果糖里面除了1～5糖外，基本沒有其它糖，其單糖是葡萄糖，二糖是蔗糖。

采用的乙腈/乙酸乙酯/水 =65/25/10（v/v/v）體系、乙腈/水=75/25（v/v）體系兩種流動相分析瑤山甜茶的小分子糖（包括單糖、二糖至五糖）。

2.3.1 基于流動相體系1的HPLC檢測 采用乙腈/乙酸乙酯/水=65/25/10（v/v/v）體系作為流動相，瑤山甜茶提取物中小分子糖的HPLC色譜圖如圖3所示。

圖3 廣西甜茶單糖高效液相分析

2.3.2 基于流動相體系2的HPLC分析檢測 采用乙腈/水=75/25（v/v）流動相體系，瑤山甜茶提取物中小分子糖的HPLC色譜圖如圖4所示。經過實驗探索后發現，該流動相體系結合1.2.4的條件，可以很好地分離低聚果糖的1～5糖，故采用低聚果糖為對照品，進行HPLC分析檢測。

2.3.3 重現性和分離度測定 在體系1中以葡萄糖重復進樣三次并測定其峰面積的方法來判斷實驗方法的重現性，在體系2中則用蔗糖來進行重現性實驗。實驗測定果糖峰面積平均值為312454，RSD（n=3）為1.53；蔗糖峰面積為181430，RSD（n=3）為1.25。兩種流動相體系中實驗所得色譜圖的特征峰的分析報告見表1。

圖4 廣西甜茶1～5糖高效液相分析

2.3.4 分析與討論 水提醇沉法是獲得植物性多糖的常用途徑，劉凌等［10］和吳曉鵬等［11］利用此法分別獲得了枸杞多糖和苦丁茶多糖。而活性炭脫色法則是多糖脫色的常用方法，鄭婷婷等［21］利用水提醇沉法得到蘆薈多糖后對其進行了活性炭脫色；在甘蔗制糖領域里，活性炭也被認為是一種高效的糖液脫色劑［22］。單糖微溶于乙醇，蔗糖不溶于乙醇，在水中特別是熱水中溶解度非常大。蔗糖在酸性水溶液中極易水解，其速度約為麥芽糖的1000倍［23］。若以得到成分較為單一或分子量較為集中的多糖為目的，一般要在水提醇沉等工藝后會對提取物進行去除單糖和低聚糖，如柴瑞娟等［24］采用了80%的乙醇5倍回流提取2h去除蕎麥中的單糖和低聚糖。本實驗以探索瑤山甜茶中的各種糖類為目的，故在乙醇沉淀獲得TPS1和TPS2后沒有采取相應的工作去除單糖和低聚糖等工作。Koh G Y等［25］利用70%乙醇沉淀得到的瑤山多糖后，采用苯酚－硫酸法直接測定其含量約為粗提物質量的11%，本文用蒽酮－硫酸法得到的結果是瑤山甜茶中全部的可溶性糖類含量，并且沒有經過粗提、醇沉等可能使糖類損失的工藝，所以結果略大于Koh G Y的結果。另外，瑤山甜茶熱水浸提溶液的pH經測定在5.6～6.0之間，這也有可能使得本來含有不多的蔗糖降解成了葡萄糖和果糖。

實驗中采用的色譜條件，基本上滿足了研究的需要，所測得的目標色譜峰分離度良好，測定結果的重現性亦表現良好。經過兩種流動相體系的測定，瑤山甜茶中主要的單糖成分為葡萄糖、果糖和木糖，以面積歸一化法計算得到果糖占有單糖的52.18%，葡萄糖占42.76%，木糖占0.54%；在本工作的色譜條件下，低聚寡糖中未檢出蔗糖成分。而在所得色譜圖中，還存在0號和6號兩個未知峰，這有待下一步工作繼續探索，要更為精確地判定瑤山甜茶所含的水溶性糖類成分，LC－MS法將是比較理想的方法。

3 結論

本文建立了瑤山甜茶可溶性總糖含量、多糖分子量以及低分子糖類種類和含量的測定方法，檢測分析了瑤山甜茶干葉中可溶性糖類的種類與含量。實驗表明，實驗中涉及的蒽酮－硫酸比色法、HPGFC、HPLC等實驗方法重現性較好，可操作性較強。本文建立的系列實驗方法以及實驗思路可以應用于其它植物資源的糖類分析。

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Determination of the soluble sugar in Rubus Suavissimus S.Lee

ZOU Qing－song，CHEN Shan*，WANG Xiao，CHEN Wei，LI Su－xia，WEI Yan－jun
（Center for Sugar Technology Research，Guangxi University，Nanning 530004，China）

To investigate the content and component of the soluble sugar in R.Suavissimus S.Lee，an anthronesulfuric acid chromatometry method was used to determine total soluble sugar content，and a high performance filter chromatography（HPGFC）was used to determine the molecular of its polysaccharide，and so was high performance liquid chromatography－evaporative light scattering detection（HPLC－ELSD）to determine the component and quantity of the monosaccharide and low－molecular－oligosaccharide.The results showed that the total soluble sugar was 15.2%with RSD of 0.996%，the molecular range was between 51551～55628.Xylose，fructose and glucose was the main monosccharide in R.Suavissimus with a content of 0.54%，52.18%and 42.76%respectively in area normalization method.

Rubus Suavissimus S.Lee；soluble sugar；anthrone－sulfuric acid chromatometry；HPGFC；HPLC－ELSD

TS207.2

A

1002－0306（2011）01－0296－04

2010－01－15 *通訊聯系人

鄒青松（1983－），男，在讀碩士研究生，研究方向：糖料資源功能研究與綜合利用。

廣西區自然科學基金項目（0731051）；廣西區研究生創新項目（105930903060）。