菊苣中菊苣酸提取工藝優化

華 春，李建玲，周 峰，周泉澄，張邊江，王仁雷*，趙夢丹(.南京曉莊學院生物化工與環境工程學院，江蘇 南京 7；.南京師范大學生命科學學院，江蘇 南京 0046；3.江蘇教育學院，江蘇 南京 003)

菊苣中菊苣酸提取工藝優化

華 春1，李建玲2，周 峰1，周泉澄1，張邊江1，王仁雷3,*，趙夢丹2
(1.南京曉莊學院生物化工與環境工程學院，江蘇 南京 211171；2.南京師范大學生命科學學院，江蘇 南京 210046；3.江蘇教育學院，江蘇 南京 210013)

以荷蘭菊苣為材料，采用高效液相色譜法測定菊苣酸的含量，建立菊苣酸提取工藝優化方法。通過單因素試驗分析回流溫度、甲醇體積分數、回流時間及料液比4個主要因素對菊苣酸提取量的影響，在單因素試驗基礎上采用L9(34)正交試驗進一步優化菊苣中菊苣酸提取工藝條件。結果表明：菊苣中菊苣酸的最佳提取工藝為回流溫度60℃、70%甲醇、料液比1:60(g/mL)、回流1h。在此條件下菊苣中菊苣酸提取量為8.808mg/g(干質量)。關鍵詞：菊苣；菊苣酸；提取工藝；高效液相色譜法

菊苣(Cichorium lntybusL.)為菊科(Asteraceae Compositae)菊苣屬(CichoriumL.)一年生或多年生草本植物。菊苣耐鹽堿，在土壤含鹽量0.168%時生長良好[1]，在江蘇的沿海灘涂廣泛分布。菊苣地上部分的葉片含有蛋白質、脂肪酸、糖類、黃酮、菊苣酸、多種維生素等生物活性成分，是一種新型的保健海水蔬菜。肉質根含有菊粉(Inulin)、綠原酸和苦味酸等，是工業和藥品的生產原料[2-3]。菊粉是一種功能性低聚果糖，也是一種可溶性膳食纖維，對控制人的體質量、改善腸道功能、防止機體失調以及老年性疾病很有幫助[4]。綠原酸和苦味酸能增加咖啡的溶解質量，緩和咖啡的刺激作用[5]，因而成為咖啡的添加物和替代品。菊苣的地上部分和地下塊根加工后的殘渣均是很好的飼料，其無氮浸出物、粗蛋白、粗灰分、粗纖維和脂肪5項營養成分指標的含量均高于玉米[6-7]。菊苣酸是菊苣莖葉中一種重要的免疫活性成分之一，近年來藥理研究表明，菊苣酸具有增強免疫功能和抗炎作用[8]，并能抑制透明質酸酶，保護膠原蛋白免受可致降解的自由基的影響[9]，還具有抑制HIV1和HIV2整合酶[10]，促進胰島素釋放[11]的作用。作為一種寶貴的植物資源，菊苣的開發利用具有廣闊前景。

目前，國內外對菊科其他植物中菊苣酸的研究有一定進展，對其提取工藝的優化研究已有報道[12]，而對菊苣中菊苣酸提取工藝及測定研究未見報道。本實驗通過對菊苣地上部分菊苣酸提取的研究，探討最佳提取工藝，為開發利用新型保健海水蔬菜菊苣提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

菊苣(Cichorium lntybusL.)種子由南京農業大學資源與環境學院提供提供。在溫度23℃，濕度88%的人工氣候室中用Hoagland營養液沙培生長30d。取其地上部分，37℃恒溫干燥箱24h烘干，粉碎過40目篩備用。

菊苣酸標準品(≥98%) 中國藥品生物制品檢定所；甲醇(色譜純)；乙腈(色譜純)。

LC-20AT型高效液相色譜儀 日本島津公司；LAC164型電子分析天平 上海精科公司；DHG-9141A型電熱恒溫干燥箱 上海博訊公司；Milli-Q超純水儀南京易普易達公司。

1.2 方法

1.2.1 菊苣酸提取工藝

精密稱取0.2g菊苣地上部分干粉，置于圓底燒瓶中，按照設定的料液比加入甲醇溶液，水浴回流，提取液濾紙過濾，再過0.25μm的微孔濾膜，濾液待用。

通過單因素試驗分析回流溫度、甲醇體積分數、回流時間及料液比4個因素對菊苣酸提取量的影響，并在單因素試驗基礎上采用L9(34)正交試驗進一步優化菊苣中菊苣酸提取工藝條件。

1.2.2 色譜條件

色譜柱Zorbax SB C18(4.6mm×150mm，5μm)；流動相乙腈-0.1%磷酸溶液(25:75)，流速0.7mL/min；柱溫40℃；檢測波長335nm，進樣量20μL[13]。

1.2.3 標準品溶液的制備

精密稱取菊苣酸標準品5mg，置50mL容量瓶中，精密加入70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，過微孔濾膜待用，即得質量濃度0.1mg/mL標準品溶液。

1.2.4 標準曲線繪制

精密量取質量濃度0.1mg/mL的菊苣酸對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，分別置于5mL容量瓶中，精密加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到質量濃度0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/mL的標準溶液。分別吸收20μL注入HPLC儀中，按照1.2.2節色譜條件測定，記錄色譜圖及其峰面積。以峰面積(Y)為縱坐標，菊苣酸質量濃度(X)/(mg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線[14]。得到標準曲線方程為：Y＝5.1×107X－13353，r＝0.9995，線性范圍0.02～0.1mg/mL。

1.2.5 菊苣酸含量測定

圖1 菊苣酸標準品色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard cichoric acide

精密稱取菊苣地上部分干粉0.2g，按照1:70料液比加入70%甲醇，50℃回流提取1.5h，提取液過濾，過濾后的提取液以0.25μm微孔濾膜過濾，取續濾液備用。按照1.2.2節色譜條件測定峰面積，再根據標準曲線計算得樣品菊苣酸的質量濃度。做3次平行實驗，取平均值。樣品色譜圖見圖2。

樣品菊苣酸含量/mg＝樣品中菊苣酸質量濃度×提取液體積

圖2 樣品中菊苣酸色譜圖Fig.2 Chromatograph of cichoric acid in extract samples

1.2.6 精密度實驗

精密吸取質量濃度0.1 mg/mL的標準品溶液20μL，測得菊苣酸的峰面積，重復5次，計算得RSD＝1.01%，n＝5。

1.2.7 穩定性實驗

精密吸取質量濃度0.087mg/mL樣品溶液，每隔1h進樣20μL，測得峰面積，重復5次，計算得RSD＝1.33%，n＝5。

1.2.8 回收率實驗

采用加樣回收法[15]，取已知含量的樣品5份，分別添加菊苣酸對照品，按樣品制備法制備供試液，按照上述色譜條件測定，計算加樣回收率，結果平均回收率為1.061，RSD＝1.33%，n＝5。

1.2.9 數據處理

所有數據均為3次平行實驗的平均值，運用SPSS統計軟件和Excel軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 回流溫度對提取效果的影響

精密稱取菊苣地上部分干粉0.2g，放入150mL圓底燒瓶中，按照1:50的料液比加入70%甲醇10mL，然后分別在40、50、60、70、80、90℃水浴條件下回流1.5h?；亓魈崛∫?，濾紙過濾，再過0.25μm微孔濾膜，計算濾液中菊苣酸提取量。

圖3 回流溫度對菊苣酸提取量的影響Fig.3 Effects of reflux temperature on cichoric acid yield

由圖3可見，隨著回流溫度的增高呈先增加后下降的變化規律?；亓鳒囟?0、50、60℃對菊苣酸提取量的影響不顯著(P＞0.05)，60、70、80、90℃對菊苣酸提取量影響極顯著(P＜0.01)，回流溫度50℃時提取效果最好，菊苣酸提取量為7.485mg/g。因此，確定最佳回流溫度為50℃。

2.2 甲醇體積分數對提取效果的影響

在其他條件不變的情況下，考察甲醇體積分數50%、60%、70%、80%、90%對提取效果的影響。

圖4 甲醇體積分數對菊苣酸提取量的影響Fig.4 Effects of methanol concentration on cichoric acid yield

由圖4可見，隨著甲醇體積分數的提高而呈先增加后下降的變化規律。甲醇體積分數50%和60%對菊苣酸提取量的影響不顯著(P＞0.05)，70%、80%、90%甲醇體積分數對菊苣酸提取量影響極顯著(P＜0.01)，其中甲醇體積分數為70%時，提取效果最好，菊苣酸提取量為7.485mg/g。因此，甲醇體積分數70%最好。

2.3 回流時間對提取效果的影響

在其他條件不變的情況下，考察回流時間分別1.0、1.5、2.0、2.5h對提取效果的影響。

圖5 回流時間對菊苣酸提取量的影響Fig.5 Effects of reflux duration on cichoric acid yield

由圖5可見，回流時間對菊苣酸提取量的影響明顯，隨著回流時間的延長，呈現先上升后下降的變化規律?；亓鲿r間與菊苣酸提取量的關系顯著(P＜0.05)，其中回流時間為1.5h時，提取效果最好，菊苣酸提取量為7.485mg/g。與其他因素水平差異顯著(P＜0.05)。因此，選定回流時間為1.5h。

2.4 料液比對提取效果的影響

在其他條件不變的情況下，考察料液比分別為1:40、1:50、1:60、1:70、1:80(g/mL)對提取效果的影響。

圖6 料液比對菊苣酸提取量的影響Fig.6 Effects of solid-to-liquid ratio on cichoric acid yield

由圖6可見，溶劑用量對菊苣酸提取量的影響明顯，隨著提取溶劑用量增大而先上升后下降。1:40、1:50、1:60(或1:70)、1:80料液比與菊苣酸提取量的關系極顯著(P＜0.01)，1:60和1:70的料液比對菊苣酸提取量的影響不顯著(P＞0.05)。料液比為1:70時，提取效果最好為8.732mg/g。由于隨著提取溶劑用量的增大試驗誤差增大，且從節約資源的角度考慮，選擇1:60為最佳料液比。

2.5 菊苣酸提取工藝正交試驗

對影響菊苣酸提取量的4個因素：回流溫度、甲醇體積分數、回流時間及料液比進行三水平四因素正交試驗。因素水平安排表1，結果見2。

表1 菊苣酸提取工藝正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of L9(34) orthogonal test design

表2 菊苣酸提取工藝L9(34)正交試驗設計及結果Table 2 Results of L9(34) orthogonal test

從表2極值可知，4個因素對菊苣中菊苣酸的提取量均有影響，各因素影響的主次順序是：回流溫度＞甲醇體積分數＞料液比＞回流時間。提取菊苣中菊苣酸的最佳工藝為：回流溫度60℃、70%甲醇、回流時間1h，料液比1:70，菊苣酸提取量為8.537mg/g。從節約能源和減少誤差的角度考慮，料液比宜采用1:60。按照最佳工藝條件進行驗證實驗，菊苣酸提取量為8.808mg/g，說明所選取的工藝確實為最佳工藝。

3 討 論

3.1 通過單因素和L9(34)正交試驗確定了提取菊苣酸的的最佳工藝條件：回流溫度60℃、70%甲醇、回流時間1h、料液比1:60，菊苣酸提取量為8.808mg/g。菊苣酸提取量為穩定性實驗(RSD＝1.33%)表明該提取工藝穩定性好。另外，操作簡便，生產成本較低的優點，為菊苣的研究與開發打下必要的基礎。

3.2 菊苣中菊苣酸的提取一般采用水、甲醇、乙醇、色譜級甲醇或超臨界萃取，由于水提取溫度較高，容易造成菊苣酸的氧化[16]且效率低；乙醇易揮發易燃燒，濃度高時組織內的菊苣酸溶解度降低導致菊苣酸不能提取出來[16]；普通分析甲醇提取容易造成有機溶劑殘留，降低產品的質量[12]；超臨界萃取成本較高，收率低，尚未完成工業化研究[12]。本實驗采用色譜級甲醇為提取溶劑，不含雜質，提取效果好，成本較低。

[1] 張琪, 陳麗萍, 陳立勛. 高產優質飼料作物: 菊苣的開發與利用[J].黑龍江畜牧獸醫, 2003(11): 51-52.

[2] 張玉, 白史且, 李達旭, 等. 菊苣開發與利用[J]. 中國野生植物資源,2009, 28(4): 10-19.

[3] SANDERSON M A, LABREVEUX M, HALL M H. Nutritive value of chicory and English plantain forage[J]. Crop Science, 2003,43(5): 1747-1804.

[4] 王文亮, 張志奇, 孫宏春, 等. 菊粉的開發與利用研究[J]. 農產品加工: 學刊, 2007(10): 90-91.

[5] 呼天明, 吳洪新, 張存莉, 等. 菊苣系列產品的開發研究述評[J]. 西北農林科技大學學報, 2006, 34(2): 34-37.

[6] CHRISVAN W, JOOST B. A rapid determination of the total suger content and the average inulin chain length in root of chicory[J]. Journal of Science of Food and Agriculture, 1998, 76(1): 107-110.

[7] McNeil-PPC Inc. Preparation of inulin products: US, 5968356[P].1999-10-19.

[8] 肖培根. 國際流行的免疫調節劑: 紫錐菊及其制劑[J]. 中草藥, 1996,27(1): 46-48.

[9] 王弘, 劉文芝, 魯曉蕾, 等. 松果菊中有效成分菊苣酸的含量測定[J].中國中藥雜志, 2002, 27(6): 418-420.

[10] ANNE-MARIE L, LIONEL F, LAURENT P, et al. A convenient synthesis of the Echinacea-derived immunostimulator and HIV-1 integrase inhibitor(-)-(2R,3R)-chicoric acid[J]. Helvetica Chimica Acta, 2002, 85(8): 2328-2334.

[11] DIDIER T, ANNE-DOMINIQUE L, ERIC H, et a1. Chicoric acid, a new compound able to enhance insulin release and glucose uptake[J].Biochemical and Biophysical Research Communications, 2008, 377(1):131-135.

[12] 鐘英杰, 李亮, 徐福亮. 紫錐菊中菊苣酸的提取工藝和含量測定[J].中國實驗方劑學雜志, 2010, 16(4): 1-4.

[13] 徐健梅, 袁其朋. 植物菊苣中菊苣酸含量的研究[J]. 天然產物研究與開發, 2008, 20(5): 87-91.

[14] 孫偉, 何冉婭, 劉漢儒. RP-HPLC法測定紫錐玉屏風顆粒中菊苣酸含量的研究[J]. 四川畜牧獸醫, 2008(12): 39-40.

[15] 羅旭彪, 陳波, 朱小蘭, 等. 紫錐菊及其復方制劑中菊苣酸的HPLC測定[J]. 中草藥, 2002, 33(10): 890-891.

[16] 吳啟林, 袁其朋, 陳養文. 紫錐菊中菊苣酸提取純化工藝研究[J]. 中草藥, 2004, 35(9): 995-997.

Process Optimization for Cichoric Acid Extraction fromCichorium lntybusL. Shoots

HUA Chun1，LI Jian-ling2，ZHOU Feng1，ZHOU Quan-cheng1，ZHANG Bian-jiang1，WANG Ren-lei3,*，ZHAO Meng-dan2

(1. School of Biochemical and Environmental Engineering, Nanjing Xiaozhuang College, Nanjing 211171, China；2. College of Life Sciences, Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China；3. Jiangsu Institute of Education, Nanjing 210013, China)

The purpose of this study was to optimize the extraction of cichoric acid fromCichorium lntybusL. by methanol reflux extraction and then establish an HPLC method for determining cichoric acid content inCichorium lntybusL. One-factorat-a-time experiments were conducted to understand the effects of reflux temperature, methanol concentration, extraction time and solid-to-liquid ratio on extraction efficiency of cichoric acid. Based on this, an L9 (34) orthogonal array design was employed to optimize extraction efficiency of cichoric acid. The results demonstrated that the optimal conditions for cichoric acid extraction were reflux temperature of 60 ℃, solid-to-liquid ratio of 1:60 (g/mL), methanol concentration of 70%, and reflux duration of 1 h. Under the optimal conditions, the extraction efficiency of cichoric acid was 8.808 mg/g dry basis.

Cichorium lntybusL.；cichoric acid；process optimization；HPLC

R284.2

A

1002-6630(2011)20-0126-04

2011-06-29

江蘇省高校自然科學基礎研究面上項目(KJD180118)；江蘇省植物生理學精品課程建設項目(2010)；江蘇省現代教育技術研究重點課題(2010)；南京市環境科學重點學科建設項目(2011)

華春(1963—)，女，教授，本科，研究方向為植物逆境生理。E-mail：hc3501988@163.com

*通信作者：王仁雷(1963—)，男，教授，博士，研究方向為植物逆境生理。E-mail：wrl3501988@163.com