荔枝與荔枝酒褐變控制

馮衛華，林麗棉，秦 艷

(仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東 廣州 510225)

荔枝與荔枝酒褐變控制

馮衛華，林麗棉，秦 艷

(仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東 廣州 510225)

以荔枝及荔枝酒為試料，研究荔枝多酚氧化酶(PPO)的酶學特性及荔枝酒發酵過程中的褐變機理及控制措施。結果表明：荔枝PPO存在同功酶，荔枝PPO最適底物為沒食子酸；以沒食子酸為底物，荔枝PPO最適反應pH值為8.0，最適反應溫度50℃，荔枝PPO的動力學參數為：米氏參數(Km)為26.033mmol/L，最大反應速度(Vmax)為34.816g/(L·min)；荔枝PPO對酸堿、對熱穩定性較差；荔枝酒發酵過程中褐變的主要原因是其PPO引起的酶促褐變。因此，低溫貯藏和高溫熱處理可有效抑制荔枝及荔枝酒在貯藏和加工中酶促褐變反應。

荔枝；荔枝酒；多酚氧化酶；酶促褐變

荔枝(Litchi chinensis Liquor)為我國亞熱帶特有水果，營養價值高，風味獨特，素有“果中之王”之美稱。每100g荔枝果肉中含有水分84g、含碳水化合物14g(熱量64千卡)、VC 36mg、蛋白質0.7g、脂肪0.6g、磷32mg、鈣6mg、鐵0.5mg、硫胺素0.02mg、核黃素0.04mg和尼克酸0.4mg[1-2]。由于荔枝采后極易褐變腐爛，所以荔枝的深加工迫在眉睫。目前荔枝的深加工產品主要有荔枝干、荔枝罐頭、荔枝果凍、荔枝濃縮汁和荔枝酒。其中，釀酒提高了荔枝的商品價值，對荔枝產業的持續發展有重要的意義[3]。

近幾年各企業紛紛推出100%荔枝汁發酵酒，其口感和工藝上都有較大的突破，但是由于技術儲備不夠完善，經驗積累不夠成熟，產品在裝瓶后或貨架期時仍然存在氧化褐變、失光等問題[3]。

褐變是果蔬在貯藏、加工期間的一個突出問題，給生產造成較大損失，國內外就這一問題成立了專門的研究機構，關于這方面的報道也很多。果蔬貯藏加工期間褐變的原因，很多研究認為主要是酶促褐變，即果蔬中的酚類物質在多酚氧化酶(polyphenol oxidase，E.C. 1. 14. 18. 1，PPO)的作用下被氧化的結果[4-6]。因此，酶促褐變的控制已成為食品工業研究的焦點[7-8]。據報道，荔枝與荔枝殼褐變其主要原因是多酚氧化酶引起的酶促褐變[9-10]，然而荔枝及其加工過程中褐變與荔枝多酚氧化酶引起的酶促褐變的相關性研究尚未報道，因而不能斷定荔枝酒加工中褐變的主要原因。本研究通過測定荔枝與荔枝酒的褐變程度及其多酚氧化酶的活性大小，考察了二者的相關性，從而確定荔枝酒褐變的主要原因；考察荔枝與荔枝酒中多酚氧化酶的最適底物、最適pH值、最適溫度以及荔枝多酚氧化酶的動力學參數、酸堿穩定性、熱穩定性及熱穩定參數，為防治荔枝及荔枝酒貯藏與加工過程中的酶褐變提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗所采用的荔枝與荔枝酒均由廣州市從化順昌源綠色食品有限公司提供。其中荔枝酒為分別發酵4、8、12、15d的樣品，樣品密封后于－25℃下保存備用。新鮮的荔枝用不銹鋼刀迅速將其果皮、果肉和果心分離，迅速裝入保鮮袋中密封于－25℃下冷凍，再用不銹鋼刀將冷凍的荔枝果肉剁碎混均，迅速裝入保鮮袋中密封，于－25℃下保存備用。

沒食子酸、福林試劑、2,2’-d i p h e n y l-1-picrylhydrazyl(DPPH)、2,4,6-tris-2,4,6-tripyridyl-2-triazine(TPTZ)等 美國 Sigma公司。

1.2 儀器與設備

UV 762紫外/可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；TGL-16G-A冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.3 荔枝果肉PPO的提取及最適底物的測定

1.3.1 荔枝果肉PPO的提取

稱取2.0g荔枝果肉，加入2mL 100mmol/L磷酸緩沖液(pH6.8)，冰浴研磨勻漿，然后于10000×g離心15min，收集上清液作為荔枝果肉PPO粗酶液，用于荔枝果肉PPO活性測定。

1.3.2 荔枝果肉PPO最適底物的測定

在4.0mL反應體系中，加入2.3mL 100mmol/L磷酸緩沖液(pH6.8)和0.2mL酶液、然后分別加入1.5mL 40mmol/L 鄰苯二酚、對苯二酚、間苯二酚和沒食子酸溶液(100mmol/L pH6.8的磷酸緩沖液溶解)，分別混勻后在室溫下420nm處測定其吸光度，從0min開始記錄每分鐘反應體系的吸光度，連續測定10min?？瞻诪椴患用敢旱姆磻w系。在測定條件下，以每分鐘吸光度改變0.001為一個酶活力單位(U)，酶活性表示為U/g 。

1.3.3 反應溫度對荔枝果肉PPO活性的影響

在4.0mL反應體系中，加入2.3mL 100mmol/L磷酸緩沖液(pH6.8)、1.5mL 40mmol/L沒食子酸溶液(100mmol/L pH6.8磷酸緩沖液溶解)和0.2mL酶液，混勻后，分別于20、25、30、35、40、45、50、55、60℃和65℃下反應，記錄每分鐘反應體系在420nm吸光度，連續測定10min，空白為不加酶液的反應體系。PPO活性以其最高酶活性相對值表示，最高相對酶活性定為100%。

1.3.4 反應pH值對荔枝果肉PPO活性的影響

首先配制100mmol/L醋酸緩沖液pH5.0及100mmol/L磷酸緩沖液(pH6.0、6.8、8.0和8.5)，并配制40mmol/L沒食子酸溶液(分別用不同pH值的醋酸緩沖液或磷酸緩沖液溶解)。在4.0mL反應體系中，加入2.3mL 100mmol/L的不同pH值的緩沖液、1.5mL 40mmol/L最適底物溶液和0.2mL酶液，混勻后于50℃溫度下反應，酶液加入后開始計時，記錄每分鐘反應體系在420nm的吸光度，連續測定10min?？瞻诪椴患用敢旱姆磻w系。PPO活性以其最高酶活性相對值表示，最高酶活性定為100%。

1.3.5 荔枝果肉PPO酶促動力學參數Km與Vmax

用100mmol/L pH8.0的磷酸緩沖液分別配制濃度30、50、70、90mmol/L沒食子酸溶液。在4.0mL反應體系中，加入2.3mL 100mmol/L磷酸緩沖液(pH8.0)、1.5mL不同濃度的沒食子酸溶液和0.2mL酶液，混勻后于50℃溫度下反應，測定PPO的活性?？瞻诪椴患用敢旱姆磻w系。求得荔枝果肉PPO的Vmax和Km值。

1.3.6 荔枝果肉PPO的熱穩定性及熱失活參數

PPO熱穩定性：將PPO酶液分別在40、50、60、70℃和80℃水浴中保溫15、30、45min和60min，迅速冰浴冷卻，然后于10000×g離心5min，收集上清液，按照酶活性測定體系測定PPO活性。PPO活性分別以其未加熱的酶活性相對值表示，未加熱的酶相對酶活定為100%。

PPO熱失活參數的計算按照Galani等的方法[11]。

1.3.7 pH值對PPO活性的影響

首先配制100mmol/L醋酸緩沖液(pH4.0～5.0)及100mmol/L磷酸緩沖液(pH6.0～9.0)，將荔枝肉按1:1的比例分別用不同pH值的緩沖液研磨提取，于10000×g離心15min，再放入4℃左右的冰箱中保持30min，最后再離心5min，并配制40mmol/L 沒食子酸溶液(分別用不同pH值的醋酸緩沖液和磷酸緩沖液溶解)。在4.0mL反應體系中，加入2.3mL 100mmol/L的不同pH值的緩沖液、1.5mL 40mmol/L 沒食子酸溶液和0.2mL酶液，混勻后于50℃溫度下反應，酶液加入后開始計時，記錄每分鐘反應體系在420nm的吸光度，連續測定10min?？瞻诪椴患用敢旱姆磻w系。PPO活性分別以其最高酶活性相對值表示，最高酶相對酶活定為100%。

1.3.8 荔枝酒PPO活性變化

在4.0mL反應體系中，分別加入0.2mL不同發酵天數的荔枝酒，然后加入2.3mL 100mmol/L磷酸緩沖液(pH8.0)和1.5mL 40mmol/L沒食子酸溶液(100mmol/L pH8.0的磷酸緩沖液溶解)，混勻后于50℃條件反應，酶液加入后開始計時，記錄每分鐘反應體系在420nm的吸光度，連續測定10min?？瞻诪椴患永笾频姆磻w系。荔枝酒PPO活性以其最高酶活性相對值表示，最高相對酶活定為100%。

1.3.9 荔枝酒色澤的測定

分別取不同發酵天數的荔枝酒，用蒸餾水作空白液，在420nm波長下分別測定荔枝酒吸光度。

1.4 數據統計與分析

每個提取試驗均重復3次，每個測定均重復3次。結果表示為平均值±標準偏差。應用SPSS 11.5軟件的One-Way ANOVA對所有數據進行方差分析，利用鄧肯式多重比較對差異顯著性進行分析；應用Pearson correlation test進行變量之間的相關性分析。P＜0.05，表示差異顯著；P＜0.01，表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 荔枝果肉PPO最適底物的測定

2016年至今，王世君擔任雞東縣農村公路縣鄉路網改造工程建設指揮部總工程師，負責農村公路工程建設及質量管理工作。農村公路施工隊伍情況復雜，管理難度大，為了保證工程質量，他從招標履約開始，對進場人員從嚴管理，對進場材料嚴格把關，對施工步驟認真監控，對工程質量做到達不到標準不驗收、不允許進入下道工序，在同事的支持下，克服重重困難，完美地完成了各項工作。

圖1 荔枝果肉PPO底物特異性Fig.1 Substrate specificity of PPO from litchi

底物不同，荔枝果肉PPO活性有很大區別。圖1結果顯示，采用沒食子酸為底物，荔枝果肉PPO活性極顯著高于鄰苯二酚、間苯二酚和對苯二酚(P＜0.01)。因此，荔枝果肉PPO的最適底物是沒食子酸。

據文獻報道，不同果蔬PPO最適底物差異很大，例如甘藍PPO最適底物為間苯三酚，茄子、生菜、蘋果PPO最適底物為綠原酸[12-15]，紫甘薯PPO最適底物是4-甲基鄰苯二酚[16]。然而，蔣世云等[10]報道，白蠟荔枝果肉多酚氧化酶最佳底物為4-甲基兒茶酚，可能荔枝品種不同，其果肉多酚氧化酶的類型存在差異，因而其果肉多酚氧化酶最適底物也有區別。

2.2 反應溫度對荔枝果肉PPO活性的影響

圖2表明荔枝果肉PPO最適反應溫度為35～50℃，其中，50℃時PPO相對酶活最大。特別是，荔枝果肉PPO活性在反應溫度35～55℃之間出現兩個吸收峰，分別在35℃和50℃，這表明荔枝果肉PPO有同功酶存在，已有文獻報道了牛蒡[17]、草菇[18]、板栗[19]等的多酚氧化酶為同功酶。

溫度對PPO的活性影響很大，一方面溫度升高，提高了反應的活化能，因而加快了其催化反應的進行；另一方面，溫度升高使酶蛋白質變性，導致酶失活，降低催化反應速度，酶促褐變是這兩種作用的協同效果[20]。因此，低溫貯藏是延緩荔枝貯藏中酶褐變的有效方法，高溫熱處理是抑制荔枝加工過程中酶褐變的有效方法。

圖2 反應溫度對PPO活性的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on PPO activity

2.3 反應pH值對荔枝果肉PPO活性的影響

圖3 pH值對PPO活性的影響Fig.3 Effect of pH on PPO activity

2.4 荔枝果肉PPO酶促動力學參數Km與Vmax

盡管PPO對于不同的底物會顯示出不同的活性，但是不能僅依此作為PPO最適底物的判定標準。PPO最適底物的選擇主要依據以下兩個因素：強底物結合能力和高催化效率，即低Km和高Vmax。Km是PPO對于不同底物的特征性常數，Km值越小，說明達到最大反應速度一半時所需底物濃度就越少，酶對底物的親和力就越大，反之亦然。Vmax則表示當PPO濃度不變時，PPO被底物飽和，反應速度達到最大的狀態[19]。

由Linewear-Burk方程[23]1/V =Km/Vmax{1/[S]}＋1/Vmax([S]為沒食子酸濃度)可得到荔枝果肉PPO的Km值與Vmax值分別為(26.033±2.188)mmol/L、(34.816±3.733)g/(L·min)。

2.5 荔枝果肉PPO的熱穩定性及熱失活參數

由圖4可見，隨著溫浴溫度的提高(40～80℃)，PPO活性下降幅度增加。溫浴溫度為8 0℃時，溫浴前15min，荔枝肉PPO相對酶活下降幅度較大(PPO相對酶活僅剩余40%左右)，溫浴60min時PPO相對酶活僅剩余20%左右。因此，果蔬生產中常采用的高溫短時熱處理工藝有利于抑制荔枝PPO酶活性，防止由于PPO引起的荔枝加工過程中的褐變反應。

圖4 荔枝果肉PPO的熱穩定性Fig.4 Thermal stability of PPO from litchi

按照Galani等[11]方法，荔枝果肉PPO在40、50、60、70℃和80℃條件反應10min的熱失活參數如表1所示。在40～80℃，荔枝肉PPO熱失活的活化能(ΔE#)為4202.8J/mol，焓變(ΔH#)的平均值為1434.1J/mol，吉布斯自由能(ΔG#)的平均值為102.4kJ/mol，熵變(ΔS#)的平均值為－303.3J/(mol·K)。

表1 荔枝果肉PPO熱失活參數Table 1 Transition state parameters for heating inactivation of PPO from litchi

熱失活ΔH#表示的是PPO熱失活形成過渡態時非共價鍵的斷裂數目[24]，可用于評價PPO熱穩定性。荔枝果肉PPO熱失活ΔH#低于西紅柿(21～29kJ/mol)[25]、蘑菇(49.8～89.3kJ/mol)[26]、紫甘薯(5.5kJ/mol)[16]等中PPO熱失活ΔH#，說明荔枝果肉PPO熱穩定性較差。荔枝果肉PPO熱失活參數結果再次表明，荔枝生產加工時可采用高溫處理來抑制荔枝果肉PPO引起的褐變反應。

2.6 pH值對PPO活性的影響

如圖5所示，荔枝果肉PPO在pH5.0～6.0時相對酶活最小，隨著pH值的上升(pH ＞6.0)或pH值的下降(pH 4.0～5.0)，荔枝果肉PPO相對酶活相對變大，此結果與反應pH值對荔枝果肉PPO相對酶活的影響結果相似。因此，調節pH值能有效抑制PPO相對酶活，可以減輕荔枝加工中的酶褐變的程度。在荔枝加工過程中，為了防止荔枝的酶褐變，可用適當濃度的酸溶液護色(pH5.0～6.0)。

圖5 pH值對PPO活性的影響Fig.5 Effect of pH on PPO stability

2.7 荔枝酒PPO活性變化與荔枝酒褐變的相關性

圖6 荔枝酒PPO活性變化與荔枝酒褐變的相關性Fig.6 Correlation between the change of PPO activity and the browning of litchi wine

將荔枝酒發酵過程中色澤變化與其PPO相對酶活變化如圖6所示，將荔枝酒發酵過程中褐變與其PPO相對酶活變作相關性分析。結果顯示，二者變化呈正相關(r =＋0.994，雙尾檢驗)，而且相關性極顯著(P＜0.01)。分析結果表明，發酵過程中荔枝酒色澤的變化是由于PPO活性的變化所致，也就是說，荔枝酒發酵過程中的褐變原因主要就是其PPO催化的酶促褐變。果蔬貯藏加工期間褐變的原因，很多研究認為主要是酶促褐變，即果蔬中的酚類物質在多酚氧化酶的作用下被氧化的結果[2-6,8,20,27-28]。這一結果與Iyengar等[5]、郁志芳[8]、Langdon[27]及馮衛華[28]的研究結果一致。

3 結 論

荔枝PPO最適底物為沒食子酸，荔枝中PPO存在同功酶。以沒食子酸為底物，荔枝PPO最適反應pH8.0，最適反應溫度50℃，Km為26.033mmol/L，Vmax為34.816 g/(L·min)。荔枝PPO對酸堿、對熱穩定性較差。因此，低溫貯藏和高溫熱處理可有效抑制荔枝在貯藏和加工中的PPO褐變反應，并且荔枝加工過程中可以用酸(pH5.0～6.0)護色。荔枝酒發酵過程中色澤變化與其PPO活性變化呈極顯著正相關(P＜0.01)，荔枝酒發酵過程中的褐變主要是由荔枝PPO引起的酶促褐變。

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Browning Control of Litchi and Litchi Wine

FENG Wei-hua，LIN Li-mian，QIN Yan
(College of Light Industry and Food, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China)

In the present study, litchi and litchi wine were used as the materials to study the properties of polyphenol oxidase(PPO) in litchi, and explore browning mechanisms and controlling strategies of litchi wine during fermentation process. The isoenzymes of PPO were observed in litchi and the optimal substrate of PPO in litchi was gallic acid. The optimal pH and temperature for PPO from litchi were 8.0 and 50 ℃ using gallic acid as the substrate. Kinetic parameters such as Kmand Vmaxof PPO from litchi were 26.033 mmol/L and 34.816 g/(L·min), respectively. The PPO from litchi was not stable at the conditions of 50 － 80 ℃, strong acid and strong alkali. Higher PPO activity in litchi was the major browning cause of litchi wine during fermentation process. Therefore, low-temperature storage and heating treatment can effectively inhibit the browning of litchi and litchi wine.

litchi；litchi wine；polyphenol oxidase；browning

TS201.1

A

1002-6630(2011)04-0246-05

2010-04-12

國家科技部星火計劃項目子課題( 2007EA781003)；廣東省科技廳項目(2007B023001002)；廣州市科技廳項目(2007Z1-E0091)；廣州市科技計劃項目(2009C6-I051)；仲愷農業工程學院項目(G2360280)

馮衛華(1968—)，女，副教授，博士，研究方向為果蔬貯藏與加工、生物活性成分提取純化及功能分析。E-mail：fengwh68@163.com