食品中單增李斯特菌環介導等溫擴增檢測技術

易海華，祝長青，宋陽威，孫慧宇，房 超，王云飛，徐 波，吳萍蘭，徐 政，徐繼承，趙金偉,*

(1.徐州出入境檢驗檢疫局技術中心，江蘇 徐州 221006；2.江蘇出入境檢驗檢疫局，江蘇 南京 210000；3.徐州醫學院公共衛生學院，江蘇 徐州 221000)

食品中單增李斯特菌環介導等溫擴增檢測技術

易海華1，祝長青2，宋陽威1，孫慧宇1，房 超1，王云飛1，徐 波1，吳萍蘭1，徐 政1，徐繼承3，趙金偉1,*

(1.徐州出入境檢驗檢疫局技術中心，江蘇 徐州 221006；2.江蘇出入境檢驗檢疫局，江蘇 南京 210000；3.徐州醫學院公共衛生學院，江蘇 徐州 221000)

目的：建立一種快速、簡單地檢測食品中單增李斯特菌的環介導恒溫基因擴增方法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，并初步建立熒光定量LAMP檢測單增李斯特菌的方法。方法：根據LAMP方法的原理，設計LAMP檢測引物，建立LAMP檢測方法，同時對方法的特異性、靈敏度、重復性及初始拷貝數的對數值與反應時間之間的線性關系進行評估。結果：使用LAMP引物可以在0.5h內完成檢測工作；LAMP檢測技術的靈敏度高出聚合酶鏈式反應檢測技術100倍以上，檢出限達到1.72×101拷貝/反應，與其他食源性致病菌無交叉反應，平均實驗間變異系數小于5%；反應時間與初始模板濃度的常用對數值有良好的線性關系(R2=0.9994)。結論：本方法具有快速、靈敏、特異、操作簡單、設備要求低的特點，具有廣闊的應用前景。

單增李斯特菌；環介導恒溫基因擴增方法；快速檢測

單核細胞增生李斯特氏菌[Listeria monocytogenes，以下簡稱單增李斯特菌(LM)]是一種革蘭氏陽性菌。它是一種人畜共患致病菌，很容易引起食品污染和李斯特菌病爆發[1]，近年來，歐美因食品感染的李斯特菌病患者呈上升趨勢，WHO已將其列為20世紀90年代以來食品中四大致病菌之一[2]。

李斯特菌檢測方法包括傳統的分離鑒定法、免疫學鑒定方法等。分離培養鑒定法比較簡單，但是操作繁瑣、耗時長，不適合日常對于食品的檢測。LM免疫學檢測操作簡便，可在同一時間內檢測大量樣品，但由于菌體及鞭毛抗原交叉反應的存在，難以進行李斯特菌種間特異性鑒別。隨著分子生物學的發展，近年來基于DNA擴增的分子生物學方法如PCR及實時熒光定量PCR不斷應用于致病菌的快速檢測。與傳統檢測方法相比較，其具有更高的靈敏度和特異性。然而此類方法本身具有費用高、對設備要求高、實用性差的缺陷限制其在基層醫療防疫和現場查驗機構中的廣泛應用。有研究者[3-4]報道的環介導等溫擴增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)特異、敏感、快速且不需要特殊儀器[5-6]。為尋找定性定量檢測單增李斯特菌更好的方法，本實驗擬利用LAMP定性、定量檢測食品中的單增李斯特菌。

本實驗采用定量LAMP的技術和設備，參考有關使用濁度變化進行相關微生物定量LAMP檢測方法和原理，研究單增李斯特菌的定性檢測和熒光定量LAMP檢測法。本實驗選擇Genebank登錄號為M24199、單增李斯特菌的溶血素基因(hly基因)序列作為目標基因，根據LAMP引物設計的基本原則設計引物，并建立LAMP檢測方法。同時，構建含hly基因的重組質粒用于熒光定量LAMP實驗標準曲線的制定和檢測靈敏度及重復性的評估。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

表1 實驗所用菌株及LAMP檢測實驗結果統計Table 1 Examined strains in this study and their specificity to LAMP primers

單增李斯特菌標準株 中國生物制品鑒定所；部分常見的食源性病原菌菌株共20株，用于分析LAMP反應體系引物的特異性，它們的編號及來源如表1所示，均購自江蘇疾病預防控制中心微生物制劑公司。

1.1.2 試劑

PCR試劑、SYBR GreenⅠ染料、LAMP引物 上海生工公司；pGEM-T easy載體系統、DNA提取試劑盒 美國Promega公司；質粒DNA提取試劑盒 美國Axygen公司；膠回收試劑盒 美國Omega公司；100bp ladder DNA-Maker 大連TaKara公司；Pico Green染料美國Molecular Probes公司；Bst DNA大片段聚合酶New England Biolabs公司；Betaine 美國Sigma公司；其他試劑為國產分析純。

1.1.3 儀器與設備

7300 PCR擴增儀 美國ABI公司；紫外凝膠成像分析系統 美國Bio-RAD公司；高速離心機 德國Heraeus公司；HZQ-C空氣浴振蕩箱 哈爾濱市東明醫療儀器廠；CS-15R低溫離心機、pH計 美國Beckman公司；精巧型恒溫混勻器 德國Eppendorf公司；AJY1b-5-U微量有機分析專用超純水機 重慶艾科浦公司；旋渦混勻器 美國IKA公司；恒溫水浴鍋 美國Memmert公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成

單增李斯特菌hly基因編碼的李斯特菌溶血素是其主要毒力因子[7]。根據單增李斯特菌基因組序列，同時比較GeneBank數據庫中相似菌株序列，顯示hly基因保守性好。采用引物設計軟件Primer Explorer 4.0設計1套2對引物，分別包括外引物F3和B3、內引物FIP和BIP(表 2)。

表2 針對單增李斯特菌hly基因序列設計的LAMP反應引物Table 2 LAMP primers based on the hly gene sequence of Listeria monocytogenes

1.2.2 基因組DNA提取及單增李斯特菌PCR擴增

1.2.2.1 DNA樣品的制備

采用熱裂解法，取適量菌加入50μL重蒸水混勻，沸水浴煮沸l0min，7000r/min離心10min，取上清液即為DNA模板。

1.2.2.2 單增李斯特菌PCR擴增

取0.2mL薄壁PCR管，向各管中加入：2×PCR Taq Mix 10μL；10μmol/L引物Mix(F3/B3) 1μL；模板DNA 2μL；雙蒸水7μL?；靹?，置于PCR擴增儀中，95℃ 30s→55℃ 30s→72℃ 30s，30個循環；72℃ 5min，4℃中止。取擴增產物各5μL，DL2000(100、250、500、1000、2000bp)分子質量標準5μL/泳道。1g/100mL瓊脂糖凝膠120V條件下電泳25min。用凝膠紫外分析儀觀察，照相保存。

1.2.3 重組質粒pGEM-T-hly構建及鑒定

用F3、B3為引物擴增hly基因，膠回收純化后與pGEM-T easy進行連接反應，轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞，過夜培養，菌落PCR方法挑選陽性克隆子。選擇鑒定為陽性的克隆子擴培，提取質粒，酶切、測序鑒定。將測序正確的質粒保存于－20℃，備用。重組質粒的構建及鑒定由深圳博睿祥暉生物技術有限公司完成。

1.2.4 單增李斯特菌LAMP檢測方法的建立

1.2.4.1 單增李斯特菌LAMP反應檢測體系的建立

對LAMP反應體系中的關鍵物質Mg2+濃度、引物濃度、反應溫度等影響因素進行探討，最終確定單增李斯特菌LAMP檢測的最佳反應體系。單增李斯特菌LAMP的總反應體系為25μL，成分包括：10×Bst buffer[200mmol/L Tris-HCl(pH8.8、25℃)，100mmol/L KCl，100mmol/L (NH4)2SO4，20mmol/L MgSO4，0.1g/100mL Triton-100) 2.5μL；Betaine(4mol/L) 5μL；引物(F3:B3:FIP:BIP=5:5:40:40，μmol/L) 1μL；Bst酶(8U) 1μL；dNTPs(10mmol/L)3.5μL；MgCl2(25mol/L) 6μL；模板1μL；滅菌去離子水4μL。反應體系配制后，立即60℃反應60min，再置80℃反應10min滅活Bst DNA聚合酶以終止反應。

1.2.4.2 單增李斯特菌LAMP擴增產物的檢測

反應結束后，6000r/min離心5min觀察沉淀結果?；蚣尤?0×Pico Green染料1μL，混勻，觀察反應管顏色是否發生變化?；蛉?μL單增李斯特菌LAMP反應產物，于1g/100mL瓊脂糖凝膠120V條件下電泳25min。用凝膠紫外分析儀觀察，照相保存。

1.2.5 單增李斯特菌熒光定量LAMP檢測方法的建立及標準曲線的制作

LAMP反應體系中加入1μL 10×SYBR GreenⅠ，置于PCR儀上進行等溫擴增反應。以測序正確并定量的重組質粒pGEM-T-hly為模板。反應結束后，以反應時間和模板拷貝數繪制曲線。

1.2.6 特異性實驗

以陽性質粒pGEM-T-hly、單增李斯特菌基因組DNA為模板進行LAMP擴增，LAMP產物進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果。

同時以陽性質粒pGEM-T-hly、單增李斯特菌基因組DNA及相關致病菌基因組DNA為模板進行LAMP擴增。采用瓊脂糖凝膠電泳、沉淀觀察結果或染色觀察結果。

1.2.7 靈敏度實驗

10倍稀釋法稀釋單增李斯特PCR產物，以定量的重組質粒為模板，進行LAMP擴增和PCR擴增。瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。

1.2.8 重復性實驗

在5個梯度水平進行10批次的重復實驗，觀察、記錄實驗結果并計算平均值、標準差、變異系數。

2 結果與分析

2.1 單增李斯特菌LAMP檢測方法的建立

LAMP反應結束后，離心觀察沉淀結果(圖1A)。加入20×Pico Green染料，混勻，加入單增李斯特菌重組質粒、單增李斯特菌基因組DNA模板的反應管可觀察到顏色變為綠色，而陰性對照則不顯示綠色(圖1 B)。瓊脂糖凝膠電泳檢測后，加入單增李斯特菌PCR產物、單增李斯特菌基因組DNA模板的反應產物有特異性的梯狀條帶出現，而陰性對照則無條帶出現(圖 1C)。

圖1 單增李斯特菌(hly基因)LAMP相關圖譜Fig.1 Quanlitative detection of Listeria monocytogenes

2.2 單增李斯特菌熒光定量LAMP檢測方法的建立及標準曲線的制作

以單增李斯特菌陽性質粒為模板建立單增李斯特菌熒光定量LAMP檢測方法，配制反應體系，在PCR儀上進行擴增反應，觀察熒光擴增曲線。反應結束后，根據反應時間和反應體系中模板的拷貝數的對數值繪制標準曲線(圖2)。結果顯示，起始模板濃度的常用對數值與循環數(Ct)值之間呈良好的線性關系(R2=0.9994)。

圖2 單增李斯特菌陽性質粒梯度稀釋后的LAMP擴增曲線Fig.2 LAMP amplification curves of recombinant plasmid carrying the hly gene of Listeria monocytogenes after gradient dilution

2.3 特異性實驗

用建立的LAMP方法分別對21株實驗株進行擴增，采用瓊脂糖凝膠電泳、沉淀法和染料染色法觀察實驗結果。驗證單增李斯特菌LAMP檢測方法的特異性。結果表明，僅以單增李斯特菌陽性質粒和單增李斯特菌基因組DNA為模板的反應管呈陽性，其他致病菌均為陰性，見表1和圖3。

圖3 單增李斯特菌菌及部分相關致病菌LAMP檢測染色圖Fig.3 Specificity test of the developed LAMP method

2.4 靈敏性實驗

通過以10倍稀釋法稀釋PCR產物為模板進行LAMP檢測和PCR擴增，采用實時熒光和瓊脂糖凝膠電泳法觀察實驗結果。結果表明，所建立的單增李斯特菌LAMP檢測方法的靈敏度是PCR方法的100倍，檢測限達到1.72×101拷貝/反應(圖4)。

圖4 單增李斯特菌LAMP檢測法與PCR法靈敏性實驗對比結果Fig.4 Comparison on sensitivity between the developed LAMP method and PCR method

2.5 重復性實驗

采用實時熒光LAMP法在5個濃度梯度水平進行10批次的重復實驗，對反應熒光信號值達到一定值時所需的時間進行統計分析，變異系數均小于5%，實驗的穩定性和重復性較好(表3)。

表3 單增李斯特菌5個梯度水平進行10批次的重復實驗結果Table 3 Repeatability test of the developed LAMP method by 10 replicate determinations at 5 levels

3 討 論

本實驗以單增李斯特菌編碼李斯特菌溶血素(LLO)hly基因為目的基因，根據LAMP反應的原理及引物設計的原則，經過優化實驗確定單增李斯特菌LAMP檢測反應體系和程序。結果表明，使用LAMP法檢測單增李斯特菌的靈敏度非常高，1.72×101拷貝/反應模板量時即可檢出，高于目前常用的PCR法100倍以上。在特異性和穩定性的實驗中LAMP法也表現出較強的特異性，沒有發現假陽性和假陰性結果。結合LAMP法檢測的優點，表明單增李斯特菌LAMP檢測方法具有在現場快速檢測和基層醫療衛生機構大規模定性使用的潛力。本實驗在定性LAMP的基礎上，探討了實時熒光定量LAMP檢測方法。實時熒光定量LAMP的主要技術優點在于：動態實時監測，能直觀地反映整個LAMP過程的動態變化；除加樣時一次開蓋外，全閉管操作，因而能有效地防止因擴增產物污染而導致的假陽性。以李斯特菌PCR產物為模板進行實時熒光LAMP反應，制作標準曲線，結果表明，初始拷貝數的對數值與反應時間的線性關系良好(R2=0.9994)。實時熒光定量LAMP技術的初步探討為LAMP技術的應用提供了新的思路，為定量檢測提供了一種新方法。

[1] 杭華. IMS2PCR快速檢測單核細胞增生李斯特氏菌[J]. 大連輕工業學院學報, 2007, 26(3): 218-220.

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Detection of Listeria monocytogenes in Foods Using Loop-mediated Isothermal Amplification

YI Hai-hua1，ZHU Chang-qing2，SONG Yang-wei1，SUN Hui-yu1，FANG Chao1，WANG Yun-fei1，XU Bo1，WU Ping-lan1，XU Zheng1，XU Ji-cheng3，ZHAO Jin-wei1,*
(1. Technology Center of Xuzhou Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Xuzhou 221006, China；
2. Jiangsu Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Nanjing 210000, China；
3. School of Public Health, Xuzhou Medical College, Xuzhou 221000, China)

Objective: To develop a rapid and simple method for qualifying Listeria monocytogenes in foods using 1oop-mediated isothermal amplification (LAMP), and to preliminarily develop a fluorescent quantitative method for the determination of this bacteria spices based on LAMP. Methods: According to the principle of LAMP, primers were designed for the development of measurement methods for Listeria monocytogenes. Meanwhile, the specificity, sensitivity and repeatability of the developed method were assessed, and the linear relationship between the logarithmized number of initial copies and reaction time was examined. Results: The detection of Listeria monocytogenes with designed LAMP primers could be finished in 0.5 h. The developed detection technique showed a sensitivity over 100-fold higher than PCR, and the limit of detection was 1.72 × 101copies per reaction. No cross-reactivity with other foodborne pathogens was observed. Avery intra-test coefficients of variation at five gradient levels of concentration were all smaller than 5%. There was an excellent linear relationship between reaction time and initial template concentration found, with a determination coefficient R2equaling 0.9994. Conclusion: This method is characterized by rapidity, high sensitivity and specificity, ease of operation, and low equipment requirements, with extensive application prospects.

Listeria monocytogenes；loop-mediated isothermal amplification (LAMP)；rapid detection

R155.31

A

1002-6630(2011)04-0203-05

2010-03-29

國家質量監督檢驗檢疫總局科研專項(2008IK159)

易海華(1977—)，男，主管醫師，本科，主要從事病原微生物診斷研究。E-mail：yihaihua88@126.com

*通信作者：趙金偉(1966—)，男，研究員，博士，主要從事分析化學研究。E-mail：zhaojw@jsciq.gov.cn