響應面法優化水飛薊粕蛋白的提取工藝

朱淑云，董 英

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江212013）

響應面法優化水飛薊粕蛋白的提取工藝

朱淑云，董 英

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江212013）

在pH、液料比、溫度及提取時間4個單因素實驗的基礎上，應用響應面分析法確定了提取水飛薊粕蛋白的最佳工藝條件。結果表明，用堿提酸沉法提取水飛薊粕蛋白的最佳條件是：pH11，液料比16∶1，溫度50℃，提取時間60min，在此條件下蛋白的提取率為54.52%。

水飛薊粕，蛋白，提取工藝，響應面法

水飛薊 silibum marianum（L.）Gaertn（milk thistle），又名水飛雉、乳雉子，為菊科水飛薊屬草本植物，以果實入藥，果實中有較大利用價值的成分主要是水飛薊素、水飛薊油和水飛薊蛋白。其中的水飛薊素具有保肝、抗氧化、抗血小板聚集和抑制癌細胞增值等生理功能［1-4］。水飛薊素主要分布于種殼中，種仁中含量極微［5］，目前國內對水飛薊資源的利用主要還是以提取水飛薊素為主，對種籽中油和蛋白的提取利用為輔，一般剩下的餅粕直接作為飼料或肥料利用，其中的營養成分沒有得到很好的利用。研究證明水飛薊粕中蛋白含量較高，氨基酸種類齊全，是一種很好的植物蛋白源［6］。本工作擬對影響水飛薊粕蛋白提取率的主要工藝參數進行單因素實驗，并以蛋白提取率為指標，采用響應面法對蛋白的提取條件進行優化實驗，以期為水飛薊的綜合開發和合理利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

水飛薊種仁 由江蘇中興藥業有限公司提供，經過低溫加壓溶劑萃取技術脫脂，然后將脫脂水飛薊粕進行粉碎過80目篩。

加壓溶劑萃取裝置 江南集團與江蘇大學聯合研制；FC-160型錘式粉碎機 上海中藥機械廠；UNICO WFJ7200可見光分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；ALPHAI-4/2-4型冷凍干燥機 德國CHRIST公司；BS110S型電子天平 北京賽多利斯儀器系統公司；LD5-2A型離心機 北京醫用離心機廠；pHS-3TC型pH計 上海天達儀器有限公司；SHZ-10組合式水浴搖床 太倉市實驗設備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 水飛薊粕蛋白提取工藝 脫脂水飛薊粕→以一定的液料比加水→調節pH→水?。ㄟ^程中控制一定的溫度和時間，并用NaOH調節pH）→3800r/min離心20min→收集上清液→調節pH5.5→3800r/min離心20min→傾去上清液→真空冷凍干燥→測定蛋白含量

1.2.2 主要成分測定方法 水分含量：105℃恒重法；粗蛋白：凱氏定氮法；粗脂肪：索氏抽提法；總糖：硫酸-苯酚法［7］；灰分：高溫灼燒法；蛋白質含量測定：考馬斯亮藍比色法［8］。

1.2.3 蛋白質提取率的計算方法：

1.2.4 水飛薊粕蛋白提取實驗 以水飛薊粕蛋白提取率為指標，分別研究了pH、提取時間、溫度、液料比對蛋白提取率的影響。在單因素實驗的基礎上，根據Box-Behnken中心組合設計原理，以水飛薊粕蛋白的提取率為響應值，選取液料比、pH、溫度這三個主要因素為自變量，設計三因素三水平RSM表，實驗因素與水平如表1所示。

表1 RSM實驗設計的因素及水平

1.2.5 pH對水飛薊蛋白沉淀率的影響［9］將提取的水飛薊粕蛋白溶液分裝到10支離心管中，分別用HCl調至不同的pH，靜置30min，然后經4000r/min離心15min，測定上清液中蛋白質的含量，利用以下公式計算水飛薊蛋白的沉淀率：

沉淀率（%）=酸沉淀前上清液中蛋白質的含量-酸沉后上清液中蛋白質的含量/酸沉前上清液中蛋白質的含量×100%

2 結果與討論

2.1 水飛薊粕蛋白提取的單因素實驗

2.1.1 pH對水飛薊粕蛋白提取率的影響 由圖1可知，pH在7～10之間時，提取率隨著pH的升高而提高，且提高幅度較大；pH達到10后，提取率增加緩慢。從實際生產考慮，提取水飛薊粕蛋白的pH在10左右較好，這樣一方面減少了加堿加酸量，降低了成本；另一方面，考慮到pH過高會引起蛋白質變性，因此要限制體系的pH。

圖1 pH對水飛薊粕蛋白提取率的影響

2.1.2 液料比對水飛薊粕蛋白提取率的影響 由圖2可知，隨著液料比的增大，提取率逐漸增加，當液料比為16∶1時，提取效果達到最佳，當料液繼續增大時，提取率略有下降，可能是由于有蛋白酶溶出，分解了部分蛋白質，因此選定提取水飛薊粕蛋白的液料比為16∶1。

圖2 液料比對水飛薊粕蛋白提取率的影響

2.1.3 溫度對水飛薊粕蛋白提取率的影響 由圖3可知，伴隨著溫度的升高，提取率也在不斷地提高，在30～40℃之間，提取率的增長速度較快，當溫度達到40℃后，提取率增長緩慢?？紤]到溫度過高會導致蛋白質變性，故選定提取水飛薊粕蛋白的溫度為40℃。

圖3 溫度對水飛薊粕蛋白提取率的影響

2.1.4 時間對水飛薊粕蛋白提取率的影響 由圖4可知，當提取時間比較短時，蛋白溶解得不充分，故提取率較低，當提取時間達到60min后，延長提取時間對蛋白的提取率影響并不大，因此選定蛋白的提取時間為60min即可。

圖4 時間對水飛薊粕蛋白提取率的影響

2.2 響應面實驗

2.2.1 響應面（RSM）設計及結果 根據3因素3水平的響應面實驗設計，共設立了15個實驗點，其中12個為析因點，3個為零點。零點實驗進行3次，以估計誤差。實驗方案及結果見表2。

表2 響應面設計實驗方案及結果

2.2.2 響應面分析與優化 RSM程序通過對各因素值和響應值分析計算，說明響應值與各因素值之間不是簡單的線性關系，進一步對回歸模型進行分析，其系數顯著性結果如表3。

表3 方差分析表

從表3中可以看出，模型是高度顯著的（P＜0.01），失擬誤差不顯著（P＞0.05），回歸方程的相關系數R2為0.9788，校正后的R2為0.9406，這說明實驗誤差小，變量與自變量之間的模型關系顯著，回歸方程與實際情況擬合良好，所以該實驗設計是可靠的。數據分析結果表明，pH、溫度和液料比對水飛薊粕蛋白提取率具有極顯著的影響，但各因素之間的交互作用不顯著。

2.2.3 最優提取工藝參數的確定及驗證 綜合考慮各種因素的相互作用，根據實驗結果和二次多項回歸方程，利用Design Expert 7.0軟件分析得到了水飛薊粕蛋白提取率最高時的工藝條件為：pH11，液料比16.18∶1，溫度49.6℃，在此條件下蛋白的提取率為55.06%?？紤]到實際生產情況，將最佳條件修正為pH11，液料比16∶1，溫度50℃，在此條件下進行三次實驗，平均值為54.52%。與理論值接近，說明采用RSM法優化得到的提取工藝參數準確可靠，具有實用價值。

2.3 pH對水飛薊粕蛋白沉淀率的影響

圖5 pH對水飛薊粕蛋白沉淀率的影響

由圖5可知，水飛薊粕蛋白的沉淀率隨pH的增加呈先增加后降低的趨勢，在pH為5.5左右時的沉淀率最高，因此我們選用蛋白質酸沉淀時的pH為5.5。

2.4 水飛薊粕及提取蛋白的主要組分分析

對脫脂后的水飛薊粕和所提取的蛋白進行成分測定，結果如表4所示。由表可見，水飛薊粕中蛋白質含量較高，具有較高的利用價值。蛋白提取液經冷凍干燥得到的蛋白粉，其蛋白含量為84.53%。提取的蛋白達到了分離蛋白的含量水平，可以作為優質蛋白利用。

表4 水飛薊粕及提取蛋白的各組分含量（%）

3 結論

本研究結合所篩選的關鍵因素利用響應面實驗設計，擬合了pH、液料比、溫度與水飛薊蛋白提取率之間的相互關系，并通過響應面分析，得到了提取水飛薊粕蛋白的最佳工藝條件：pH11，液料比16∶1，溫度50℃，在該條件下蛋白提取率達到54.52%，所提取的蛋白含量為84.53%。

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Optimized technology for extracting milk thistle cake protein by response surface methodology

ZHU Shu-yun，DONG Ying
（School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China）

Based on single-factor test analysis，the optimum conditions including pH，liquid-solid ratio，temperature and extraction time of milk thistle cake protein by alkaline extraction and acid precipitation were determined through response surface methodology.The condition were as follows：pH11，liquid-solid ratio16∶1，temperature50℃and extraction time 1h.The protein extraction rate was 54.52%under the condition.

milk thistle cake；protein；extraction technology；response surface methodology

TS201.1

B

1002-0306（2011）02-0256-03

2010-01-26

朱淑云（1975-），女，講師，在讀博士，研究方向：食品科學。

江蘇大學高級人才科研啟動基金項目（09JDG027）。