家蠶核型多角體病毒基因與抗病育種

孫波 周洪英 吳宏麗

摘要：家蠶（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｌ．）對家蠶核型多角體病毒（Ｂ． ｍｏｒｉ Ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ，ＢｍＮＰＶ） 抗性為不完全顯性，在常染色體上由主效基因控制，在性染色體上有微效基因的協同作用?？梗拢恚危校窒嚓P基因的研究，為生產上進行防治提供了理論基礎。ＲＮＡ干涉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）技術被廣泛應用于基因功能研究，為ＢｍＮＰＶ抗性品種培育提供了新的方法。隨著分子標記技術的不斷完善和應用，在家蠶抗性品種輔助選育方面也取得了一定的成果，并且有獲得家蠶抗性新品種的報道。

關鍵詞：家蠶；家蠶核型多角體病毒；抗性；基因；育種

中圖分類號：Ｓ８８４．５＋１；Ｑ７８；Ｓ８８２．２ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）16－3249-04

Gene of Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus and Disease Resistance Breeding

ＳＵＮ Ｂｏ，ＺＨＯＵ Ｈｏｎｇ－ｙｉｎｇ，ＷＵ Ｈｏｎｇ－ｌｉ

（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｒｏｐｓ， Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｗｕｈａｎ ４３００６４， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： The resistance of Bombyx mori to B. mori Nuclear polyhedrosis virus（BmNPV） was incomplete dominance，and ｗａｓ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｂｙ ｍａｊｏｒ ｇｅｎｅ ｏｎ ａｕｔｏｓｏｍｅ ａｎｄ ｍｉｎｏｒ ｇｅｎｅ ｉｎ ｓｅｘ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ． Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｏｆ ＢｍＮＰＶ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｔｈｅ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ ｉｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ＢｍＮＰＶ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｖａｒｉｅｔｙ． Ａｓ ｔｈｅ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ， ｓｏｍｅ ａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂ. ｍｏｒｉ Ｌ． ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｎｄ ｓｏｍｅ ｎｅｗ ＢｍＮＰＶ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ｗｅｒｅ ｒｅｐｏｒｔｅｄ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｌ．； ＢｍＮＰＶ； ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ； ｇｅｎｅ； ｂｒｅｅｄｉｎｇ

家蠶核型多角體病毒（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｌ． Ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ，ＢｍＮＰＶ）是昆蟲病毒史上首先發現的病毒，屬于桿狀病毒科，包涵體亞科；它引起的家蠶核型多角體病毒病是養蠶業三大病毒病中危害最為嚴重的一種。該病在世界養蠶國家常呈暴發態勢，傳染性極強，難以控制，危害最為嚴重，常造成巨大的經濟損失。蠶業界多年來一直在尋找抗病基因，以闡明抗性機理、培育抗性品種，目前在很多領域已取得了一定的進展。

１傳統抗ＢｍＮＰＶ品種選育

家蠶遺傳學試驗表明，家蠶對ＢｍＮＰＶ的抗性，無論是經創傷感染或經口感染，不同的品種存在著較大的差異［１］。家蠶對ＢｍＮＰＶ抗性為不完全顯性，在常染色體上由主效基因控制，在性染色體上有微效基因的協同作用存在［２］，但抗性主基因至今無法鑒定。

傳統的抗ＢｍＮＰＶ品種選育，多通過添毒試驗，獲得具有該病毒抗性基因的品系，然后通過基因轉育的方法獲得抗性品種；或者通過轉基因的方法獲得抗性品種。在選育抗ＢｍＮＰＶ家蠶品種時，首先找到抗性很強的品種做親本材料，再將抗性導入經濟性狀優良的家蠶品種中，同時必須實行多代連續經口接種ＢｍＮＰＶ以進行個體和蛾區（系統）選擇；配制雜交組合時，中國系統品種、日本系統品種兩方都應有強抗性的親本，并且即使抗性品種（系統）大體穩定或育成，也還必須不斷地進行ＢｍＮＰＶ接種以強化抗性的選擇。作為生產用的抗性雜交組合，其母種一代有必要再進行ＢｍＮＰＶ接種的抗性選擇，以保持其抗性。

朱勇等［３］以１０個家蠶原種和２個家蠶雜交品種為材料，采用機率分析法研究了不同家蠶品種對ＢｍＮＰＶ的抗性差異。結果表明，不同家蠶品種對ＢｍＮＰＶ的抗性差異達到了極顯著水平?？剐灾饕芪⑿Ф嗷蚩刂?，并具有偏父性遺傳現象，而且日本系統品種的抗性比中國系統品種強；這與１９６３年易文仲的研究報道一致，錢荷英等的報道也證實了這一點［４］，并且雜交Ｆ１代對ＢｍＮＰＶ的抗性存在較強的雜種優勢。劉震等［５］對６個家蠶品種中腸消化酶活性與家蠶對ＢｍＮＰＶ病毒抗性進行了比較與分析，結果表明，中腸消化酶活性越強的抗性越強，呈顯著的正相關關系，可以把家蠶對ＢｍＮＰＶ抗性與中腸消化酶活性的關系應用到家蠶抗性品種的選育中，把測定家蠶中腸消化酶活性作為選育和鑒定抗ＢｍＮＰＶ病毒家蠶品種的一種輔助方法。

２抗ＢｍＮＰＶ相關基因研究進展

１９９９年美日科學家合作完成了ＢｍＮＰＶ（Ｔ３株）的全基因組測序，共鑒定了１３６個開放閱讀框（ＯＲＦ），其中包括了許多ＢｍＮＰＶ繁殖的關鍵基因，如ＤＮＡ解旋酶（ＤＮＡ ｈｅｌｉｃａｓｅ）、ＤＮＡ復制酶（ＤＮＡ ｐｏｌ）、衣殼蛋白（Pｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）等［６］。ＤＮＡ解旋酶在病毒侵染家蠶的極早期表達，而病毒的早期表達基因更容易受到宿主因子的影響［７］。ＢｍＮＰＶ的ＤＮＡｈｅｌ基因與舞毒蛾核型多角體病毒（Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｓｐａｒ Ｌ． Ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ，ＬｄＮＰＶ）的ｈｒｆ－１基因和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（Ａｃｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ Ｍ． Ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ，ＡｃＮＰＶ）的ｐ１４７基因為同源基因，是病毒的宿主域因子。各種病毒重組試驗證明，只要擁有了對應的宿主域因子，就可以在對應的宿主中繁殖，反之則不能繁殖［８，９］。楊金宏等［１０］根據ＧｅｎＢａｎｋ公布的ＢｍＮＰＶ（１３株）序列，設計引物對其ＤＮＡ解旋酶基因的核心結構域進行了ＰＣＲ擴增，結果成功克隆了該基因，并利用雙酶切亞克隆構建了酵母雙雜交誘餌載體ＰＧＢＫＴ７。試驗證明重組誘餌載體不能自激活，可以作為誘餌進行蛋白結合試驗，該研究為抗ＢｍＮＰＶ的家蠶品種鑒定提供了依據。

ＢｍＮＰＶ的基因庫為Ｌ３３１８０，這對于家蠶核型多角體病毒的研究有很大的幫助。其中Ｐ１０基因啟動子控制ＢｔｅｒｙＩＡ（ｂ）截短基因，在ＡｃＮＰＶ多角體基因上游ＥＣＯＲ Ｖ位點克隆構建有包膜（ＯＣＵ＋）的重組病毒Ｉ，可以將ＡｃＮＰＶ宿主域擴展至家蠶等。Ｐ１０基因是一個極晚期高表達的非必需結構基因，用它取代ＯＣＵ基因（多角體蛋白基因）構建轉移載體，將使重組病毒的包涵體外殼完整保留，適于作為基因工程病毒殺滅劑，具有較好的應用前景。Ｐ１０基因與多角體形態發生及多角體膜的形成有關，可以為生產上進行家蠶核型多角體病毒病的防治提供理論基礎。

３利用ＲＮＡｉ技術抗ＢｍＮＰＶ研究進展

１９９５年，Ｓｕｉ等［１１］在研究線蟲ｐａｒｌ基因功能時，首次發現雙鏈ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）能抑制特定基因的功能。１９９８年，Ｆｉｒｅ等［１２］將ｄｓＲＮＡ抑制特定基因表達的現象，正式命名為ＲＮＡ干涉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ），隨后在許多生物中都相繼發現存在ＲＮＡｉ現象。ＲＮＡｉ技術被廣泛應用于基因功能研究，成為近年來發展應用最迅速的分子生物學技術，為家蠶核型多角體病毒抗性品種的培育提供了新的方法。

２００４年，Ｉｓｏｂｅ等［１３］第一次報道了利用ＲＮＡｉ技術增強了轉基因細胞及家蠶對ＢｍＮＰＶ的抗性。在以ＢｍＮＰＶ重要的晚期表達因子ｌｅｆ－１為靶基因的ＲＮＡｉ試驗中，成功建立了表達ｌｅｆ－１雙鏈ＲＮＡ的轉基因ＢｍＮ細胞系，在轉基因細胞及家蠶中均抑制了ＢｍＮＰＶ的增殖，但是并沒有降低感染病毒家蠶的死亡率。徐穎等［１４］將體外轉錄的與ＤＮＡ解旋酶基因和ＤＮＡ聚合酶相對應的ｄｓＲＮＡ轉染到了家蠶培養細胞的ＢｍＮ中，成功抑制了ＢｍＮＰＶ的復制。夏定國等［１５］以ＢｍＮＰＶ復制必需的極早期基因ｉｅ－１和細胞釋放型病毒ＣＲＶ入侵關鍵基因ｇｐ６４為靶序列，分別人工設計并體外轉錄出ｄｓＲＮＡ Ｉ１（４３８ ｂｐ）和ｄｓＲＮＡ Ｇ1（３３７ ｂｐ），用家蠶培養細胞ＢｍＮ研究目標ｄｓＲＮＡ對ＢｍＮＰＶ復制、增殖的抑制效果。結果表明，ｄｓＲＮＡ Ｉ１能有效地抑制ＢｍＮＰＶ在ＢｍＮ細胞中的增殖，最大抑制效果使培養液中的病毒滴度（ＴＣＩＤ）比對照降低了104.30倍；ｄｓＲＮＡ Ｇ１能顯著地抑制新形成的病毒粒子的細胞侵染能力，最高可使培養液中的病毒滴度降低１０３．１７倍，這為進一步通過轉基因技術進行家蠶病毒病防治研究建立了技術基礎。ｇｐ６４是細胞出芽型病毒的囊膜蛋白，對ＢｍＮＰＶ的細胞間傳播起關鍵作用。如果抑制了ｇｐ６４的表達，理論上就可以抑制ＢｍＮＰＶ的繁殖。夏定國等［１６］在體外合成ｄｓＲＮＡ試驗中，通過病毒滴度試驗、實時定量ＲＴ－ＰＣＲ法研究了ｇｐ６４基因的不同區域、不同長度與ＲＮＡｉ效果的關系，結果表明，供試的６個ｄｓＲＮＡ的最大抑制效果相當（滴度ＴＣＩＤ５０的最大抑制差值為４．００左右），經ＲＮＡｉ不同時間點的ｇｐ６４ ｍＲＮＡ表達水平均明顯出現了下調（Ｐ＜０．０１），其中４８ ｈ的ｇｐ６４ ｍＲＮＡ的表達量約為對照的１／３００。位于ｇｐ６４ ＯＲＦ的１３９０～１４９９位點（Ｇ３－３）是ＲＮＡｉ的較佳靶位點，為進一步構建與基因序列互補的ＲＮＡｉ質粒載體提供了依據。

黃科等［１７］將ＢｍＮＰＶ的ＤＮＡ聚合酶基因、蛋白激酶（ＰＫ１）基因以及ｂｒｏ－ｄ和ｏｒｆ１６２９基因的部分編碼片段，分別以其反向重復的形式與家蠶Ａｃｔｉｎ３啟動子連接，構建了基于ｐｉｇｇｙＢａｃ轉座子載體的轉基因表達載體，通過顯微注射于家蠶卵中，獲得了３６～１０７個Ｇ１蛾區，得到了２０～２３頭轉基因陽性家蠶。經Ｓｏｕｔｈｅｒｎ雜交及ＲＴ－ＰＣＲ分析表明，ＢｍＮＰＶ的４個反向重復片段都已經導入了家蠶基因組中，并且可以進行轉錄。攻毒試驗結果表明，ＢｍＮＰＶ的ＤＮＡ聚合酶基因和ＰＫ１基因反向重復片段對病毒的增殖有抑制作用，從而使家蠶對ＢｍＮＰＶ具有一定的抗性。而ＢｍＮＰＶ的ｂｒｏ－ｄ和ｏｒｆ１６２９基因反向重復片段對病毒的增殖沒有抑制作用。在培養細胞中，導入ＢｍＮＰＶ的ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＤＮＡ ｈｅｌｉｃａｓｅ以及ＩＥｌ、ｇｐ６４、ｌｅｆ－１等基因的ｄｓＲＮＡ，都使ＢｍＮＰＶ的復制得到顯著的抑制。利用轉基因家蠶持續穩定表達與ＢｍＮＰＶ的復制必需基因同源的ｄｓＲＮＡ，有可能增強家蠶對ＢｍＮＰＶ的抗性，進而選育出高抗性的品種。

ＲＮＡｉ技術是近幾年興起的一項更有效、更特異、更徹底的轉錄后基因沉默技術，利用ＲＮＡｉ技術，破壞并抑制與病毒的宿主細胞識別蛋白、基因組復制因子、病毒結構蛋白等相關基因ｍＲＮＡ的翻譯，是目前真核生物病毒病分子技術治療的一個最新策略。

４從蛋白質組水平上研究家蠶對ＢｍＮＰＶ的抗性

目前，家蠶抗ＢｍＮＰＶ的研究主要是在致病機理、傳染途徑、ＤＮＡ分子標記和轉錄水平等方面，家蠶蛋白質組水平研究還在剛起步階段。蔡克亞等［１８］利用遺傳學原理，通過雜交和回交的方法，建立了家蠶抗ＢｍＮＰＶ、感ＢｍＮＰＶ以及近等基因系模型，利用２－Ｄ電泳和ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ ＭＳ質譜技術，從蛋白質組水平上研究家蠶對ＢｍＮＰＶ的抗性。結果獲得了家蠶高抗ＮＢ、高感３０６、近等基因系ＢＣ８五齡起家蠶血淋巴液蛋白質差異表達譜，分別獲得了１８０、１９０、１８７個蛋白點，其中８０％的蛋白點集中在等電點５～９范圍之內。從３塊凝膠上共獲得明顯差異蛋白點ｌ２個，由質譜鑒定出５種蛋白，其中氨基?；福ǎ粒恚椋睿铮幔悖欤幔螅澹﹥H出現在抗性品系ＮＢ、近等基因系圖譜中，感性品系沒有出現，初步推測是家蠶抗ＢｍＮＰＶ特有蛋白，為首次報道。針對特定病毒基因的轉基因ＲＮＡｉ技術，可使家蠶獲得對該病毒的抗性，因而有望成為今后家蠶抗病育種的新手段。

５分子標記輔助育種研究進展

遺傳標記是基因組研究的重要內容，是構建物種遺傳圖譜的基礎。根據家蠶對ＢｍＮＰＶ抗性遺傳規律的特殊性，陳克平等［２］提出了常染色體上ＮＮ主基因和性染色體上Ｚ＋Ｚ＋修飾基因的控制假設，并得到試驗的驗證。利用近等基因系尋找抗性分子標記，其交配方式不同，可分別構建ＮＮ、Ｚ＋Ｚ＋、ＮＮＺ－Ｚ＋ ３種近等基因系，同時提出了Ｆ２群體尋找分子標記的交配方式。目前，已有多項分子標記技術用于家蠶基因組的研究，并構建了幾種家蠶分子標記遺傳圖譜。劉曉勇等［１９］在含有抗核型多角體病毒病主效基因的家蠶品系ＮＢ和高感品系３０６及其近等基因系ＢＣ９中，采用５００個ＲＡＰＤ隨機引物，分別在各個品系的ＤＮＡ混合物中進行擴增以篩選分子標記，獲得了與家蠶抗ＢｍＮＰＶ病有關的３個分子標記，它們分別是ＯＰＦ－０７２０２３、ＯＰＪ－１３１３００、ＯＰＭ－１６１２００。其中ＯＰＦ－０７２０２３標記通過各回交代檢測，證明獲得的標記真實、可靠；又對該分子標記的片段進行克隆、測序；通過該片段的生物信息學分析，意外地在家蠶Ｚ染色體上發現了一個逆轉位子的編碼序列，值得進一步深入研究。

近年來，隨著分子標記技術的不斷完善，已經迅速地被應用于動植物新品種的選育過程中；在家蠶抗性品種輔助選育方面也取得了一定的成果，并且有獲得抗性家蠶新品種的報道。姚勤等［２０］對家蠶抗核型多角體病毒病以不同的雜交方式，構建了３種近等基因系，用ＲＡＰＤ技術篩選出了抗病主基因連鎖分子標記ＯＰＡ－１８７００和感病連鎖分子標記ＯＰＹ－１１４００；同時在群體中驗證了抗性分子標記的有效性［２１］，并利用我國家蠶種質資源中發現的高抗ＢｍＮＰＶ的品系ＮＢ和高感品系３０６，組配了近等基因系。采用ＲＡＰＤ技術獲得分子標記，將標記轉換成ＳＣＡＲ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）標記，利用ＳＣＡＲ標記開展了家蠶抗性新品種的輔助育種選擇，獲得了家蠶抗ＢｍＮＰＶ新品種。曹錦如等［２２］利用分子標記技術向家蠶實用品種中導入核型多角體病毒病抗性基因，結果發現已報道的分子標記在不同品種間表現出差異，與抗性性狀并非完全相關。添毒結合標記檢測，篩選出抗性品種多化Ｎ和敏感性的實用品種春華，將其作為育種素材，又從特定品種多化Ｎ中獲得了特異性連鎖片段。通過組配近等基因系，結合添毒試驗，在雜交組合ＢＣ３的Ｆ２代抗性個體中明顯檢測到了該標記，初步表明該分子標記具有一定的可靠性。

６展望

家蠶核型多角體病毒病危害嚴重，半個多世紀以來，人們對該病害的病原類型、侵染途徑、預防方法、家蠶品種抗性、遺傳規律，育種方法等諸多方面進行了研究。目前在生產上，以防為主、綜合防治、培育對病原有較強抗性的家蠶新品種一直都是人們的努力方向。但是，由于家蠶對ＢｍＮＰＶ的抗性為不完全顯性，既受常染色體上的主效基因控制，又受性染色體上的微效基因協同作用，加之環境因素的影響，使傳統的雜交育種方法難以育出實用性強的家蠶品種。

近年來，現代生物技術飛速發展，為家蠶抗病育種提供了理論基礎和新的技術途徑，并且已經有利用分子標記技術培育出家蠶抗ＢｍＮＰＶ新品種的報道。但是，由于受家蠶的抗性遺傳規律和品種選育的要求限制，在短時間內還難以得到穩定、優良的抗性品種。隨著生物技術的發展，相信在家蠶抗性品種培育方面會有更大的進步。

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