岳麓山白三葉草異黃酮提取方法比較研究

周 鑫,彭婷婷,張 偉,李雪姣,姚 丹,莫 輝,彭伏鐳,馬 銘*

(1. 湖南師范大學化學生物學及中藥分析省部共建教育部重點實驗室，中國 長沙 410081； 2. 湖南師范大學附屬中學，中國 長沙 410081)

白三葉草，又名白車軸草，是一種車軸草屬多年生草本植物[1]．原產于歐洲，現廣泛分布于溫帶及亞熱帶地區．我國新疆、云南、四川、貴州、湖南、湖北等地都有野生分布，長江以南多省有大面積種植．民間曾以其全草入藥，具有安神鎮靜、清熱涼血、祛痰止咳、鎮靜止痛的功效[2]．

近年來，三葉草的研究受到了廣泛的關注．國內外學者對車軸草屬植物進行了大量的分離提取研究，得到了多種活性成分．Foo和Lu等用丙酮對白三葉進行了回流提取，通過大孔吸附樹脂分離得到了多種酚類物質[3]；Maher 和Hughes通過浸漬法從白三葉中提取了亞麻苦苷和百脈根苷的混合物[4]．Klejdus[5]等從紅三葉草中分離得到46種異黃酮化合物，其中刺芒柄花素和鷹嘴豆芽素A含量最高，約占干重的0.1%～0.9%，遠遠高于其他植物．研究表明，車軸草中的異黃酮類化合物具有抗癌、植物雌激素樣作用以及抗氧化和清除自由基的功能，能抑制胃潰瘍、胃癌、乳腺癌及腸癌等[6]，還能有效預防和治療動脈硬化[7]、骨質疏松[8]等疾病，因而成為人們關注的焦點．

浸漬法和回流法作為常見提取方法被廣泛應用于三葉草活性物質的提取過程中[3-4,9]，但具有耗時、耗能等缺點．近年來微波和超聲波技術開始被應用于異黃酮的提取過程中．于麗娜[10]等人通過單因素及正交實驗優化了用超聲波法提取紅三葉草總異黃酮的實驗條件；金汝城等人[11]采用密閉微波提取裝置對紅車軸草異黃酮成分進行了提取工藝的研究．然而到目前為止，檢索國內外文獻，很少有關于白三葉草異黃酮提取方法的對比研究報道．由于自然界中異黃酮的資源十分有限，因此選擇一種省時、高效、綜合提取效果好及環境友好的提取方法對充分利用白三葉草資源，實現規?；崛【哂惺种匾囊饬x．本文利用微波輔助提取法、超聲輔助提取法和回流提取法對白三葉草中的異黃酮類化合物的提取進行了研究，通過對比3種提取方法，獲得了岳麓山白三葉中異黃酮的最佳提取方法和工藝參數，研究結果可為岳麓山乃至全國白三葉的研究與開發提供參考依據．

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1100液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)，由G1312A液相泵，G1316A 柱溫箱，G1315 二極管陣列檢測器，7725手動進樣閥和10 μL微量進樣器組成；TU-1221紫外-可見分光光度計(北京通用儀器設備公司)；MCR-3型微波化學反應器(鞏義市予華儀器有限責任公司)；CQ250超聲清洗儀(上海船舶電子設備研究所)； DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市英予華儀器廠)；AB204-N電子分析天平(瑞士梅特勒儀器有限公司)；SHB-III循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)．

白三葉草樣品2009年7月雨后采自岳麓山腳，經湖南師范大學生命科學學院植物學系劉克明教授鑒定后，曬干、粉碎、過40目篩備用．

刺芒柄花素標準品(純度>98%，杰輝生物技術有限公司)、無水乙醇(分析純，天津市大茂化學試劑廠)、乙腈(色譜純，湖南化工研究院精細化工研究所)、甲醇(色譜純，湖南化工研究院精細化工研究所)、超純水(由Millipore公司的Milli-Q純水系統制得)．

1.2 色譜條件

色譜柱為大連江申Spherigel ODS C18 柱(5 μm，250×4.6 mm I.D.)，流動相流速為1.0 mL/min，檢測波長為249 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL．

流動相：A：超純水；B：乙腈．采用A∶B=53∶47的等度洗脫．

1.3 實驗方法

準確稱取一定量的白車軸草樣品，加入提取溶劑，在設定條件下提取一定時間．減壓抽濾，定容至50 mL即為待測樣品溶液．取待測樣品溶液，過0.45 μm濾膜，在選定色譜條件下進液相色譜分析，得樣品提取液中刺芒柄花素的濃度c(mg/L)．按下式計算三葉草樣品異黃酮的提取量(Extract content of isoflavones, μg)： 異黃酮提取量(μg)=c×V×Y，其中V為提取液體積(mL)，Y為稀釋倍數，并以異黃酮的提取量高低衡量異黃酮的提取效率，異黃酮的提取量高說明異黃酮的提取效率高．

2 結果與討論

2.1 色譜分離分析條件的選擇

據文獻報道，白車軸草中所含的異黃酮主要是美皂異黃酮、染料木素和刺芒柄花素，其中刺芒柄花素的百分含量在80%以上，且由于染料木素和美皂異黃酮的含量隨季節和產地的不同變化較大[12]，故選刺芒柄花素作為標準對照品，并以刺芒柄花素的含量代表異黃酮的含量．

圖1 刺芒柄花素的紫外吸收光譜

配制6 mg/L的刺芒柄花素標準溶液，在200～400 nm的波長范圍內進行光譜掃描，得光譜圖如圖1所示．圖1表明，標準溶液在249 nm處有最大吸收，故選擇249 nm為測定波長．

用乙腈和水做流動相進行HPLC分析，流速設定為1.0 mL/min，改變乙腈-水的配比，發現以乙腈-水(v乙腈∶v水=53∶47)作流動相時能達到最佳分離效果，樣品中各成分的保留時間短且分離效果好．刺芒柄花素標準溶液的色譜圖和樣品提取液的色譜圖如圖2和圖3．對比圖2和圖3可知，樣品提取液色譜圖中峰1為刺芒柄花素的色譜峰．另外，在樣品提取液的色譜圖(圖3)中，還有兩個色譜峰-峰2和峰3，它們對應的紫外光譜圖與峰1(刺芒柄花素)對應的紫外光譜圖對比如圖4．圖4顯示，圖3中峰1對應的紫外光譜圖與刺芒柄花素標準溶液的紫外光譜圖形狀完全一致，進一步說明圖3中峰1是刺芒柄花素的色譜峰．而峰2和峰3的紫外光譜圖與文獻[13]報道的三葉草中其他異黃酮類化合物的紫外光譜圖均不相符，說明峰2和峰3代表的物質不屬于異黃酮類物質．為此，我們選擇以刺芒柄花素含量來定量岳麓山白三葉總異黃酮含量．

圖2 刺芒柄花素標準溶液的色譜圖

圖3 樣品提取液的色譜圖

圖4 樣品提取液色譜圖(圖3)中峰1(a)、峰2(b)和峰3(c)的紫外光譜

2.2 標準工作曲線

準確配制濃度分別為c=0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 mg/L的刺芒柄花素標準溶液，分別經0.45 μm濾膜過濾，在選定色譜條件下進液相色譜分析，以刺芒柄花素色譜峰面積A對濃度c做圖，發現刺芒柄花素濃度在0～10.0 mg/L 范圍內，色譜峰面積與濃度呈良好線性關系，線性回歸方程為A=59.26c-4.91，相關系數為r=0.999 8．

2.3 微波輔助提取單因素試驗

2.3.1 固液比對異黃酮提取效率的影響 準確稱取6份1.000 g的白三葉草樣品，選用體積分數60%的乙醇作為提取溶劑，微波功率400 W，溫度60 ℃，提取120 s，提取溶劑過濾后用60%的乙醇溶液定容至50 mL，進行色譜分析．考察了固液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30時對異黃酮提取效率的影響，依次獲得了119.5、144.0、172.9、188.9、191.7和194.0 μg的異黃酮提取量．結果說明，隨著固液比的增加，白三葉草中異黃酮的提取效率依次增大．但當固液比達到1∶20后，再增大溶劑的用量，異黃酮的提取效率增加趨勢趨于平緩，說明當固液比達到1∶20時，提取溶劑已經能夠將樣品中的異黃酮接近完全地提取出來．考慮到溶劑用量過大不利于后續的濃縮和純化，從節能和提高工作效率角度考慮，我們選擇固液比為1∶20開展后面的研究．

2.3.2 提取溶劑乙醇濃度對異黃酮提取效率的影響 選擇1∶20的固液比，在2.3.1相同的條件下，考察了提取液乙醇體積分數分別為20%、40%、60%、80%和100%時，對異黃酮提取效率的影響，結果如圖5．

由圖5可知，隨著乙醇濃度從20%增加到60%，白三葉草異黃酮提取效率不斷增大，但當乙醇體積分數大于60%時，異黃酮的提取效率反而降低．根據文獻[14]報道，黃酮類化合物在植物體內大多會與糖結合成甙，也有部分以游離狀態的甙元形式存在．甙和極性較大的甙元，一般易溶于乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、水或某些極性較大的混合溶劑．而大多的甙元易溶于極性較小的溶劑，如乙醚、氯仿等．為此，我們認為白三葉草異黃酮提取效率隨乙醇濃度先增大后減小的原因，可能是因為刺芒柄花素在白三葉草中是以甙的形式存在，由于甙包括易溶于乙醇、難溶于水的刺芒柄花素甙元和易溶于水的糖基，因此，提取溶劑需要同時兼具較好的脂溶性和水溶性．增加提取溶劑中乙醇的濃度，有利于脂溶性甙元基團的溶解，從而增加了甙的提取效率；而更大濃度的乙醇，將不利于水溶性糖基的溶解，從而降低甙的提取效率．甙被提取出來后，在熱的水溶液中，很容易被植物中存在的酶水解成甙元和糖．因此，甙的提取效率的高低直接決定著甙元(刺芒柄花素)提取效率的高低．結果說明，提取液乙醇體積分數選擇60%為最佳．

2.3.3 提取時間對異黃酮提取效率的影響 選擇提取液乙醇體積分數為60%，在2.3.2相同的條件下，考查了提取時間分別為20、60、80、120、140和180 s對提取效率的影響，結果如圖6．

圖5 乙醇濃度對異黃酮提取效率的影響

圖6 微波提取時間對異黃酮提取效率的影響

由圖6可知，隨著提取時間的延長，異黃酮的提取效率在80 s內達到最大．但當提取時間大于80 s時，可能由于溶液溫度過高，不僅易破壞異黃酮的物質結構，也會導致乙醇的揮發，異黃酮的提取效率反而減?。虼?，微波輔助提取的提取時間選擇80 s為宜．由以上條件實驗可得到微波輔助提取的最佳條件為：乙醇體積分數60%，固液比1∶20，提取時間80 s．

2.4 超聲輔助提取和回流提取法單因素試驗

按照微波輔助提取相同的方法，考查了超聲輔助提取法(超聲功率為250 W)和回流提取法(回流溫度為85 ℃)的提取條件，結果列于表1和表2．

表1 超聲輔助提取單因素試驗結果

表2 回流法提取單因素試驗結果

由表1可知，超聲輔助提取的最佳提取條件是乙醇體積分數60%，固液比1∶15，提取時間40 min；回流提取法的最佳提取條件為乙醇體積分數60%，固液比1∶25，提取時間3 h．在最佳的提取條件下，超聲輔助提取法和回流提取法分別獲得了173.7 μg和的171.5 μg的異黃酮提取量．

比較3種提取方法說明，微波輔助提取所需提取時間短、異黃酮提取效率高.這是由于黃酮類化合物主要存在于細胞質中，被細胞壁包圍而不易被提取.傳統的熱水、堿、有機溶劑提取法，受細胞壁主要成分纖維素的阻礙，使得提取效率較低．而微波是一種非電離的電磁輻射，被輻射物質的極性分子在微波電磁場中快速轉向及定向排列，產生撕裂和相互摩擦引起發熱，從而保證了能量的快速傳遞和充分利用[14]，有利于在較短的時間內獲得較高的提取效率．另外，與超聲輔助提取法相比，微波輔助提取法幾乎不產生噪音；與回流提取法相比，微波輔助提取法能大大節約能量.因此，微波輔助提取法是一種快速、高效和環境友好的方法．

3 結論

通過單因素試驗考察了岳麓山白三葉草中異黃酮的幾種提取方法，獲得了最佳提取條件為：微波輔助提?。阂掖俭w積分數60%，固液比1∶20，微波時間80 s；超聲輔助提?。阂掖俭w積分數60%，固液比1∶15，超聲時間40 min；回流提取法：乙醇體積分數60%，固液比1∶25，回流時間3 h．在各自最佳實驗條件下，進行對比實驗，結果表明微波輔助提取法明顯優于超聲輔助提取法和回流提取法，其提取量可以達到210.6 μg(1.000 g樣品)，是一種省時、高效、環境友好的提取方法．研究采用常見、無毒、安全的乙醇溶液作為提取溶劑，避免了使用有毒有害提取溶劑給提取物帶來的污染，符合藥物安全規范，本文的研究結果可以為岳麓山白三葉異黃酮的合理、有效利用和開發提供有價值的參考．

參考文獻：

[1] 國家中醫藥管理局《中華本草》編委會. 中華本草: 第4卷[M]. 上海: 上?？茖W技術出版社, 1999: 3418-3419.

[2] 江蘇新醫學院. 中藥大辭典[K]. 上海: 上?？茖W技術出版社, 1992: 1012-1013.

[3] FOO L Y, LU Y, MOLAN A L,etal. The phenols and prodelphinidins of white clover flowers[J]. Phytochemistry, 2000, 54: 539-548.

[4] MAHER E P, HUGHES M A. Isolation of linamarin-lotaustralin fromTrifoliumrepens[J]. Phytochemistry, 1971, 10 (12): 3005-3007.

[5] KLEDJUS B, VITAMVSOV-TRBOVD, KUBV. Identification of isoflavone conjugates in red clover (Trifoliumpratense) by liquid chromatography-mass spectrometry after two-dimensional solid-phase extraction[J]. Anal Chim Acta, 2001, 450: 81-97.

[6] LAM A N C, DEMASI M, JAMES M J,etal. Effect of red clover isoflavones on Cox-2 activity in murine and human monocyte/macrophage cells[J]. Nutrition and Cancer, 2004, 49(1): 89-93.

[7] MEIJER G W， FRANKE W C， REDDY P R. Composition for lowing blood cholesterol:US, 6787151[P].2004-09-07.

[8] POTTER S M, HENLEY E C, TAYLOR R B. Hormone replacement therapy: US, 6326366[P].2001-12-04.

[9] PONCE M A, SCERVINO J M, ERRA-BALSELLS R,etal. Flavonoids from shoots and roots ofTrifoliumrepens(white clover) grown in presence or absence of the arbuscular mycorrhizal fungus Glomus intraradices[J]. Phytochemistry, 2004, 65: 1925-1930.

[10] 于麗娜, 張永忠, 辛 禹,等. 超聲波法提取紅三葉草總異黃酮的研究[J]. 食品工業科技, 2006, 27(9): 124-126.

[11] 金汝城, 趙國磊, 李貴文,等. 微波輔助提取紅車軸草異黃酮的工藝研究[J]. 食品科學, 2007, 28(9): 165-168.

[12] 徐桂花. 三葉草春季植物雌激素的含量變化及種和品種間差異[D]. 南京:南京農業大學, 2005.

[13] DE RIJKE R， ZAPPEY H， ARIESE F,etal. Flavonoids in leguminosae: analysis of extracts ofT.pratenseL.,T.dubiumL.,T.repensL., andL.corniculatusL. leaves using liquid chromatography with UV, mass spectrometric and fluorescence detection[J]. Anal Bioanal Chem, 2004, 378: 995-1006.

[14] 李鳳林, 李青旺, 馮彩寧, 等. 天然黃酮類化合物提取方法研究進展[J]. 中國食品添加劑, 2008(5): 60-64.