UFC1基因在乳腺癌和正常乳腺組織中的表達

賀愛蘭, 張 波, 劉如石

(1.湖南人文科技學院生命科學系，中國 婁底 417000；2.湖南中醫藥大學基礎醫學院，中國 長沙 410208；3.湖南師范大學生命科學學院，中國 長沙 410081)

近年來，我國惡性腫瘤發病率越來越高，腫瘤嚴重威脅著人類健康，其中乳腺癌是一種嚴重威脅女性生命健康的惡性腫瘤之一，其患病率占女性惡性腫瘤的第一位．迄今為止，乳腺癌的病因及其惡性進展的具體機制尚未完全闡明，與其他惡性腫瘤一樣，乳腺癌其形成與發展是一個多基因參與、多步驟進行及多階段發展的過程．隨著分子生物學的快速發展，一種新的途徑引起人們的關注，即泛素 (ubiquitin)系統[1]．

泛素在20世紀70年代中期被發現，隨后與泛素類似的小蛋白家族，稱泛素樣蛋白(ubiquitin-like proteins，UBLs)被報道，并且新成員不斷增加．Ufm1(ubiquitin-fold modifier 1)是泛素樣蛋白家族的新成員，通過 Uba5 (E1) 和UFC1 (E2)共價結合到靶蛋白上[2-3]．在人類的基因組中，有12個多E2家族基因．其中，UFC1就是一種E2類似酶[4]，特異性地作用于Ufm1．UFC1在泛素系統中的作用越來越引起人們的重視，但對于UFC1的其他功能研究報道還比較少，特別是UFC1在乳腺癌發生和發展中的作用研究還未見報道，有待更進一步的研究和探討，這是一項全新而有意義的工作．

1 材料與方法

1.1 材料

T4 DNA 聚合酶購自 TaKaRa；RNA反轉錄試劑盒為Promega公司產品；UFC1多克隆抗體購自Santa Cruz公司；二抗辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG和辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠 IgG 購于Jackson Immuno Research公司；SABC法免疫組化染色試劑盒和GAPDH單克隆抗體購自武漢博士德公司；新鮮的乳腺癌和正常乳腺組織來自湖南省湘雅附二醫院的手術切除，所有乳腺癌病例術前均未進行輔助化療和放療．

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR法檢測UFC1基因在組織中的mRNA相對表達水平 TRIZOL法提取乳腺癌組織和正常乳腺組織總 RNA，各取2 μL 進行瓊脂糖電泳檢測其完整性；取5 μg 總RNA，構成20 μL反應體系，按Promega的反轉錄試劑盒說明書進行cDNA的合成．根據GenBank ( NM_016406 ) 登錄的人UFC1基因序列，應用Primer Premier 5.0 設計上下游引物，以GAPDH為內參照．UFC1引物序列：上游引物5′-GATCGTGAGTTGTGGGTGCA-3′，下游引物5′-TGTTGGATGACGCCCTTCTG-3′，擴增片段長度413bp；GAPDH引物序列：上游引物5′-AATCCCATCACCATCTTCC-3′,下游引物5′-AGTCCTTCCACGATACCAA-3′，擴增片段長度 308 bp．UFC1和GAPDH擴增條件相同，反轉錄產物2 μL為模板，總反應體積20 μL，擴增條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 45 s，30個循環；72 ℃ 10 min．擴增產物經12 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察后．應用電泳凝膠成像分析系統分析擴增產物的D值并拍照，以UFC1 mRNA與GAPDH mRNA的D值比表示UFC1 mRNA的相對表達水平，以比值大于0.05為陽性表達．

1.2.2 Western blot 法檢測UFC1基因在組織中的蛋白質表達水平 Western blot檢測新鮮標本40例：乳腺癌組織 20例，癌旁正常乳腺組織 20例，貯存于-80 ℃ ．不同乳腺組織各 50 mg，經組織裂解液均漿后置于冰上30 min，12 000 r /min離心15 min，吸取上清為細胞總蛋白．測定蛋白質濃度后，取 50 μg蛋白，向樣品中加入適量的6×上樣緩沖液，100 ℃水浴10 min，經125 g/L十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠 ( SDS-PAGE )電泳后，將蛋白質轉印至PVDF膜，并用含50 g/L脫脂奶粉的TBS緩沖液封閉30 min；以標準蛋白為參照，隨后與一抗(檢測UFC1蛋白時用多克隆抗體；檢測GAPDH蛋白時用單克隆抗體)結合2 h，用TBST 緩沖液洗膜4次，每次10 min；再與二抗(羊抗兔；羊抗鼠)結合1 h，TBST 緩沖液洗膜4次．最后用化學發光法顯影．UFC1蛋白在 19 000處顯示特異性條帶，以相對分子質量為 36 000的GAPDH為內參．掃描存檔并用Image J 軟件分析．

1.2.3 免疫組織化學法檢測UFC1基因在組織中的表達情況 乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織經常規甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚度連續切片，常規脫蠟．將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液 (pH6.0)，電爐或微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔5～10 min后，反復1～2 次進行熱修復抗原．冷卻后PBS (pH 7.2～7.6)洗滌1～2 次．滴加 50 g/L BSA封閉液，室溫20 min．甩去多余液體，不洗．滴加適當稀釋的一抗(UFC1多克隆抗體)，37 ℃ 1 h左右或20 ℃ 2 h左右．也可 4 ℃過夜．PBS (pH 7.2～7.6)洗2 min×3 次．滴加生物素標記的二抗工作液山羊抗兔IgG， 20～37 ℃ 20 min． PBS (pH 7.2～7.6)洗 2 min×3 次．滴加試劑SABC，20～37 ℃ 20 min．PBS (pH 7.2～7.6)洗 5 min×4 次．最后DAB顯色．以 PBS代替一抗作為陰性對照．

1.2.4 統計學分析 所有數據均用均數±標準差表示．用SPSS15.0進行統計處理，統計學采用t檢驗或方差分析，以P<0.05判定差異的顯著性．

2 結果與分析

2.1 UFC1基因在不同乳腺組織中的相對表達水平

使用RT-PCR法檢測乳腺癌組織和對應的癌旁正常乳腺組織中UFC1基因的 mRNA的相對表達水平，結果顯示，乳腺癌組織中UFC1 mRNA平均相對表達水平為0.587±0.062 (見圖1)；正常乳腺組織中UFC1 mRNA平均相對表達水平為0.264±0.029(見圖2)．另外，檢測結果還發現，乳腺癌組織與正常乳腺組織中UFC1 mRNA表達水平差異顯著，有統計學意義(P<0. 05)．

M：Marker；1～20泳道：20例乳腺癌組織；看家基因GAPDH為內參圖1 用RT-PCR檢測20例乳腺癌組織中UFC1 mRNA的表達

M：Marker；1～20泳道：20例對應的癌旁正常乳腺組織；看家基因GAPDH為內參圖2 用RT-PCR檢測20例對應的癌旁正常乳腺組織中UFC1 mRNA的表達

1～4泳道：乳腺癌組織(圖1中的17～20號標本)；5～8泳道：對應的癌旁正常乳腺組織(圖2中的17～20號標本)；看家基因GAPDH為內參圖3 用Western blot 檢測UFC1在乳腺癌組織和正常乳腺組織中的表達

2.2 Western blot 檢測結果

在預染色蛋白標準約19 000處，可見UFC1特異性蛋白條帶．圖像分析發現，正常乳腺組織中僅有少量UFC1蛋白的表達．在乳腺癌組織中，UFC1蛋白表達明顯增強，是正常乳腺組織表達量的 3.15倍(見圖3)．UFC1在正常乳腺組織中平均相對表達水平為0.445±0.056，在乳腺癌組織中平均相對表達水平為1.403±0.075，UFC1在乳腺癌中的表達與正常乳腺組織中的表達有顯著性差異(P<0. 05)(見表1)．

表1 Western blot 檢測UFC1在乳腺癌組織和正常乳腺組織中的表達(UFC1/GAPDH的IOD比值)

2.3 免疫組織化學法檢測結果

正常乳腺組織切片可見正常乳腺細胞中UFC1的表達很少(圖4A、B、C)．乳腺癌組織切片可見大量癌細胞呈陽性表達，呈棕黃色，數量多而濃染(圖4D、E、F)．免疫組織化學法檢測結果顯示UFC1主要在癌細胞的細胞質中表達．

A：正常乳腺組織(圖2中的1號標本)；B：正常乳腺組織(圖2中的19號標本)；C：正常乳腺組織(圖2中的20號標本)；D：乳腺癌組織(圖1中的1號標本)； E：乳腺癌組織(圖1中的19號標本)； F：乳腺癌組織(圖1中的20號標本)．圖片中箭頭表示有陽性信號的部位．圖4 用免疫組織化學法檢測UFC1在正常乳腺組織和乳腺癌組織中的表達

3 討論

目前對蛋白質泛素化降解途徑與腫瘤發生的關系方面的研究取得了長足的進步[5-6]，UFC1在泛素系統中的作用越來越引起人們的重視，對其結構的研究越來越多[3-4]．已有研究表明：在老鼠體內，Ufm1修飾系統參與了造血的調控[7]；在利什曼原蟲體內，該系統在線粒體的功能調節中有著重要作用[8]．最近還發現了Ufm1修飾系統的類泛素連接酶Ufl1 (E3)和底物C20orf116，它們主要定位于內質網[9]．但對于UFC1基因在腫瘤，特別是在乳腺癌方面的作用研究還未見報道．

本實驗以UFC1為研究對象，分別應用RT-PCR法、Western-blot 法、免疫組織化學檢測 20例乳腺癌患者的乳腺癌組織及其對應的癌旁正常乳腺組織中UFC1基因的表達水平，并進行比較，結果都表明乳腺癌組織中UFC1基因的表達明顯高于正常乳腺組織，其表達量的不同，提示UFC1基因與乳腺癌的發生和發展有著密切關系．為將UFC1作為新的靶分子引入腫瘤的臨床治療提供實驗依據．因此對乳腺增生性疾病進行UFC1檢測有利于早期發現乳腺癌，根據檢測結果判斷病變向乳腺癌發展的風險性，并有可能通過UFC1抑制劑的應用減少乳腺癌的發生．因此，作者認為UFC1在乳腺癌的發生發展中發揮重要作用，而UFC1 在各種乳腺組織中的作用機制尚待進一步研究．

參考文獻：

[1] HERSHKO A. Ubiquitin-mediated protein degradation [J]. J Biol Chem, 1988, 263(30):15237-15240.

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[3] LIU G, ARAMINI J, ATREYA H S,etal. GFT NMR based resonance assignment for the 21 kDa human proteinUFC1 [J]. J Biomol NMR, 2005, 32(3):261.

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[6] HERSHKO A, CIECHANOVER A, ROSE I A. Resolution of the ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes: a component that interacts with ATP[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1979, 76(7): 3107-3110.

[7] TATSUMI K, YAMAMOTO-MUKAI H, SHIMIZU R,etal. The Ufm1-activating enzyme Uba5 is indispensable for erythroid differentiation in mice [J]. Nat Prod Commun, 2011, 2:181.

[8] GANNAVARAM S, SHARMA P, DUNCAN R C,etal. Mitochondrial associated ubiquitin fold modifier-1 mediated protein conjugation in Leishmania donovani [J]. Plos One, 2011, 6(1):e16156.

[9] TATSUMI K, SOU Y S, TADA N,etal. A novel type of E3 ligase for the Ufm1 conjugation system [J]. J Biol Chem, 2010, 285(8):5417-5427.