改良新生大鼠雪旺細胞的體外培養和純化

陶曉宇, 滕曉華, 劉 波, 段 答, 盧 明

(湖南師范大學第二附屬醫院(解放軍第163醫院)神經外科, 中國 長沙 410003)

雪旺細胞( Schwann cells, SCs)是周圍神經系統由胚胎時期的神經嵴前體細胞演化形成的膠質細胞，可吞噬變性壞死碎片[1]、分泌神經營養營養因子和神經生長因子[2]以及引導軸突再生[3]．多項研究[ 4-7]表明雪旺細胞移植能促進脊髓損傷、周圍神經損傷和中樞神經系統脫髓鞘性疾病等的功能恢復．近年來已成為周圍神經修復領域研究的熱點．本實驗研究了從新生大鼠中獲得高純度SCs并于體外不斷傳代和增殖的方法．

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

新生SD大鼠(出生第5 d)10只(中南大學湘雅醫學院動物部)，DMEM培養基(Gibco)，胎牛血清FBS(Hyclone)，胰蛋白酶和膠原蛋白酶(Gibco)，L-多聚賴氨酸(Sigma )，阿糖胞苷(Ara-C)(Sigma )，鼠抗S-100(Sigma)，小鼠二步法檢測試劑盒(中彬金橋生物工程有限公司)，D-Hank’s液和0.01 mol/L PBS均為本實驗室配制，離心管和50 mL玻璃培養瓶，解剖顯微鏡(北京泰克儀器有限公司)，倒置相差顯微鏡(OLYMPUS)．

1.2 雪旺細胞的分離和培養

將新生SD大鼠放入盛有絡合碘的燒杯中浸泡(完全淹沒)消毒15 min，用無菌組織剪依次剪開皮膚、皮下組織，充分暴露坐骨神經，換另外一把組織剪剪取雙側坐骨神經置于盛有D-Hank’s的培養皿中，解剖顯微鏡下仔細剝離神經鞘膜，PBS洗滌2遍，眼科剪剪碎成0.5 mm3大小， 0.25%(體積分數，全文同)胰蛋白酶和0.03%膠原酶Ⅰ37 ℃水浴混合消化30 min，搖勻后沉淀5 min，吸取上清單細胞懸液移入盛有含10% FBS的 DMEM培養液終止消化，向剩余沉淀內繼加上述胰酶和膠原酶繼續于37 ℃水浴中混合消化30 min后加入含10% FBS的 DMEM 培養液終止消化，巴氏吸管吹打后用80 μm的細胞篩過濾，離心 (1 500 r/min,5 min),棄上清液，用含 10% FBS的 DMEM培養液重新懸浮，吹散制成單細胞懸液，調整細胞密度至 1×105個/mL，接種到50 mL玻璃培養瓶內,置于37 ℃、5%CO2溫箱中培養．

1.3 雪旺細胞的純化

差速貼壁法+Ara-c抑制法：將上述單細胞懸液接種到50 mL玻璃培養瓶內側放入培養箱，15 min后轉另外一側放置，30 min后平放，45 min后將未貼壁細胞懸液調整濃度為1×105個/mL，重新接種到多聚賴氨酸包被的50 mL玻璃培養瓶內，24 h后加入Ara-C(終濃度為2 mg/L)，48 h后全量換液，并用PBS洗滌一遍，以除去Ara-C的作用，加入不含血清的DMEM培養液，置于37 ℃、5%(體積分數)CO2培養箱中培養，以后每2～3 d半量換液一次．待細胞長滿培養瓶底部 80%面積時,進行傳代，加入適量0.125%胰蛋白酶，在倒置相差顯微鏡下控制消化時間，待雪旺細胞突起收縮后，立即加入含10%(體積分數)胎牛血清的DMEM培養液終止消化，用吸管輕輕吹打瓶底，再行差速貼壁 15 min×1次，30 min×1次．

1.4 雪旺細胞的鑒定

將純化后的雪旺細胞調整細胞濃度為1×105個/mL，接種到蓋玻片(事先用多聚賴氨酸包被)的六孔培養板內，繼續培養2 d后，細胞長滿玻片的80%，取出蓋玻片，行S-100免疫組化染色鑒定，具體步驟：(1)10.6 g/L PBS洗滌2遍，3 min/遍．4%(體積分數)多聚甲醛固定液于4 ℃冰箱中固定20 min；(2)滴加3%(體積分數)雙氧水去內源性酶活性15 min；(3)兔血清37 ℃孵育30 min；(4)滴加鼠單克隆抗體S-100，4 ℃濕盒中過夜；(5)滴加小鼠二步法檢測試劑盒工作液，室溫下30 min；(6)滴加DAB液顯色3～5 min．以上各步驟之后均以10.6 g/L PBS洗滌2遍，3 min/遍．

2 結果

消化后初接種的細胞呈圓形，原代接種24 h后85%以上的細胞呈橢圓或短梭形，胞體飽滿，透光性好，有短小突起，其中仍可見少量胞體較大、輪廓不清、透光性較差的成纖維樣細胞，Ara-C作用24 h后，極少見到成纖維樣細胞，易于與SCs區分．培養第3 d，SCs開始緩慢增殖，SCs 胞體變得更細長、 狹窄, 突起更長、排列更緊密．培養第8、9天，SCs迅速增殖，細胞密集、融合呈漩渦狀．S-100免疫細胞組化染色陽性反應細胞達98%，胞質和突起呈棕褐色，胞核淡染．相差顯微鏡下不同時間點SCs形態照片和S-100免疫細胞化學染色后的SCs照片見圖1～4．

圖1 相差顯微鏡下原代培養24 h雪旺細胞形態(×200) 圖2 相差顯微鏡下原代培養7 d雪旺細胞形態(×400)

圖3 相差顯微鏡下原代培養9 d雪旺細胞形態(×400) 圖4 第2代S-100免疫組化陽性細胞(×400)

3 討論

新生大鼠坐骨神經含結締組織較少，操作方便，接種后容易貼壁生長，成纖維細胞相對較少，SCs增殖分裂能力比成年大鼠的強[8]，但剛出生1～2 d的新生大鼠坐骨神經十分細小，且與周圍組織粘連，不易于分離，故選用出生后第5天的．消化時間過長會損害分離出的單個細胞，消化時間過短，分離出的單細胞太少，本試驗采用分步消化的方法，避免了消化酶對細胞的過多損害并獲取了大量高活性的單細胞．污染細胞主要為成纖維細胞，在光滑玻璃瓶內，成纖維細胞一般在接種后30 min左右開始貼壁，SCs則一般需1 h以上，本實驗在傳統的差速貼壁方法上做了改進，利用梯度時間點行差速貼壁，在最大程度降低成纖維細胞數量的同時也減少了SCs的丟失，阿糖胞苷是有絲分裂抑制劑，在接種24 h后加入可在成纖維細胞生長高峰期顯著抑制其分裂增殖[9]，新生鼠細胞增殖能力和速度強，對阿糖胞苷敏感，因此時間從既往的作用48 h縮短到24 h，而雪旺細胞在培養初的幾天內增殖緩慢，到第8、9天達到增殖的高峰期，阿糖胞苷對其影響小，從而改良后的實驗方法既起到了抑制成纖維細胞的作用，同時對雪旺細胞的擴增無明顯影響．該實驗通過梯度時間點多次差速貼壁聯合24 h阿糖胞苷抑制法獲得了高純度和高活性的雪旺細胞，鼠抗S-100免疫組化證實SCs純度達到98%．說明通過精細取材，分步消化，階段差速貼壁法和適時阿糖胞苷抑制法純化后SCs的純度得到提高．

SCs作為周圍神經系統的髓鞘形成細胞，能分泌生長因子和為軸突生長提供良好的微環境，在軸突延伸過程中兼起接觸引導和神經營養作用[2-3]，在周圍神經再生中起重要的作用，對于周圍神經缺損修復有重要意義．SCs體外培養和純化是進一步研究其分泌蛋白、神經修復功能的前提．本實驗所建立的培養和純化方法在其他研究的基礎上有所改進，不僅簡單易行而且從最大程度上去除了可能污染的細胞，使細胞得到了純化，為利用SCs做進一步的研究提供了一定的理論基礎．

參考文獻：

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