應用重疊延伸法合成人源明膠基因及其克隆

段慧明,陳勁春

(北京化工大學生命科學與技術學院,北京 100029)

明膠是一種從動物(牛、馬 豬)的膠原結締組織和皮經過一系列化學處理以后所得到的蛋白質．干燥后的明膠涂層呈透明狀，具有一定的機械強度．在感光工業， 醫藥工業、食品工業以及其他工業中獲得非常廣泛的應用．明膠因使用原料、生產方式和質量不同又分為食用明膠、醫用明膠、工業明膠、骨膠和照相用膠等．明膠可以從許多不同來源的膠原蛋白制?。９?、皮、豬皮和魚是主要的商業來源．因此，它可能來源于農業或者非農業．明膠也用作啤酒的澄清劑和很多產品的穩定劑、增稠劑和組織形成劑．

目前國內還沒有表達重組明膠的相關報道，國內生產明膠都是通過物理化學方法提取獲得．制造明膠的過程包括從動物組織提取膠原并將其轉化成明膠．這個過程產生大小和電荷均不同的多肽異源混合物．使用微生物系統制造明膠是另一種策略．這種策略包括通過表達具有特定長度和組成的膠原基因片段直接產生明膠．使用這些膠原片段的研究表明它們能被用作明膠的許多醫學用途的動物源明膠的替代品[1]．

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α由本實驗室保存，克隆質粒pGEM-T、T4DNA連接酶購自Promega公司，pfu、Taq酶、限制性內切酶HindⅢ、SnabⅠ、SalⅠ購自Takara公司．玻璃奶購自博大泰克公司，DNAMarker購自華美公司．其余試劑為國產分析純．PCR引物由Invitrogen 公司合成,PCR反應在PERKIN ELMER公司2400型擴增儀上進行．

培養基：LB、LB固體平板按英駿公司的方法配制．

1.2 分子克隆常規操作

質粒提取、PCR產物回收參照分子克隆實驗手冊進行．

1.3 寡核苷酸片段的合成

參照人Ⅰ型膠原蛋白α1鏈結構基因的序列選取了α1鏈第531～630個氨基酸的編碼序列設計人工合成該基因的方案．并且首先將該基因的序列進行遺傳密碼的優化設計，即根據密碼子使用偏好把人的編碼方式改變為畢赤酵母的編碼方式，將編碼膠原蛋白的基因分成10段，相鄰兩個片段之間的互補序列長度為17～20個堿基．在該基因的5＇端引入了SnabⅠ酶切位點，在3＇端引入了HindⅢ酶切位點．全基因序列的劃分情況如表1所示(帶下劃線處均為重疊區), 寡核苷酸片段的合成由北京英駿公司完成．

表1 化學合成人源明膠基因的寡核苷酸片段

1.4 寡核苷酸片段的連接和組裝

采用重疊延伸PCR技術，按如下方法將寡核苷酸片段連接成一完整人源明膠基因：①將明膠基因片段1～10分別重疊延伸形成寡核苷酸片段(1～4)、(5～8)、(9～10)，PCR反應體系為0.2 μL dNTP(25 mmol/L)、0.2 μL pfu酶、2 μL 10×Buffer、寡核苷酸片段、純凈水16.8 μL,總反應體系為20 μL．PCR反應條件：94 ℃預變性5 min→[94 ℃，1 min→64 ℃ 1 min→72 ℃ 1 min] ×25個循環→72 ℃ 10 min→4 ℃；②將步驟①得到的PCR產物回收后按(1～4)→(5～8)連接，反應體系為0.2 μ LdNTP(25mmol/L)，引物1和引物8各0.5 μL, 2 μL 10×Buffer, (1～4) 和 (5～8)回收片段各0.5 μL, 0.2 μLpfu酶, 純凈水15.6 μL,總反應體系為20 μL．PCR反應條件：94 ℃預變性5 min→[94 ℃，1 min→55 ℃ 1 min→72 ℃ 5 min] ×1個循環(獲得1～8模板)，暫停加引物1和8各0.5 μL→94 ℃預變性5 min →[94 ℃，1 min→64 ℃ 1 min→72 ℃ 1 min] ×25個循環→72 ℃ 10 min→4 ℃;③將步驟②得到的PCR產物回收后按(1～8)→(9～10)連接,反應體系為0.2 μL dNTP(25 mmol/L)，引物1和引物10各0.5 μL, 2 μL 10×Buffer, (1～8) 和 (9～10) 回收片段各0.5 μL, 0.2 μL pfu酶, 純凈水15.6 μL, 總反應體系為20 μL ,PCR反應條件同步驟2．至此，得到全基因．

1.5 人源明膠基因的克隆

以1.4中得到的(1～10)為模板, 用引物1和引物10擴增得到全基因，PCR反應體系為：0.5 μL dNTP(25 mmol/L)、0.5 μL Taq酶、1 μL(1～10)模板、引物1和引物10各1 μL，5 μL 10×Buffer，41 μL 水，總反應體系為50 μL，PCR反應條件同上．PCR反應后走15 g/L瓊脂糖凝膠電泳, 檢測擴增片段的大小和特異性, 將目的片段切下, 用玻璃奶法回收純化目的片段．

1.6 目的片段的克隆及重組子篩選

將回收的目的片段克隆到Promega公司的pGEM-T載體上，轉化大腸桿菌DH5α，涂布于含有氨芐青霉素的平板上，培養過夜，挑取菌落接種培養，用堿變性法進行質粒DNA的小量提取，酶切鑒定．

1.7 DNA序列測定

將鑒定正確的菌液送英駿公司對擴增的目的基因片段測序確定堿基序列．

2 結果

2.1 組裝與克隆

組裝與克隆步驟如圖1所示.

圖1 化學合成基因流程圖

2.2 PCR 擴增及其產物的電泳鑒定結果

以PCR產物1～10為模板,引物1和10分別為上游和下游引物進行PCR擴增,擴增條件見方法1.4,擴增產物進行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳,電泳結果見圖2．

2.3 人源明膠基因的全序列測定

經過測序，序列與理論序列一致，該基因全長300 bp，帶下劃線處分別為SnabⅠ、HindⅢ酶切位點.

1：明膠基因PCR擴增產物；M：100 bp DNA plus圖2 目的基因PCR擴增產物

3 討論

膠原蛋白的結構基因由于具有三聯體Gly-X-Y結構，重復序列較高，采用傳統的磷酸化補齊方法很難獲得目的基因，而重疊延伸PCR技術(gene splicing by overlap extension PCR,簡稱SOE PCR)[2-3]由于采用具有互補末端的引物,使PCR產物形成了重疊鏈,從而在隨后的擴增反應中通過重疊鏈的延伸,將不同來源的擴增片段重疊拼接起來． 其原理是: 使用2對引物P1，P2和P3，P4經過第一輪PCR分別擴增出2個DNA片段A和B，其中P2和P3為內引物，具有部分序列重疊互補，使A的3′端和B的5′端具有同源互補序列; 第二輪PCR再以A和B混合作為模板，經變性，退火，復性時，A的正鏈和B的負鏈的3′端同源互補序列將結合在一起，使兩條鏈互為引物，通過PCR得到延伸和擴增，從而連接A和B． 其特點是不需要使用限制性內切酶和連接酶，可以避免引入限制性酶切位點的核苷酸序列，可將2個DNA片段精確地連接在一起． 使用這種方法時，為了盡可能避免或減少堿基錯配，往往需加大模板、引物和dNTP的用量，同時減少PCR的循環數，因此有時在其PCR產物的凝膠電泳圖像中仍可見模板DNA的相應條帶．因此應用SOE時，每一輪PCR產物最好經電泳分離后切膠回收純化以除去多余的引物和其他非特異序列．此技術利用PCR技術能夠在體外進行有效的基因重組,而且不需要內切酶消化和連接酶處理,可利用這一技術很快獲得其他依靠限制性內切酶消化的方法難以得到的產物．重疊延伸PCR技術成功的關鍵是重疊互補引物的設計．重疊延伸PCR在基因的定點突變、融合基因的構建、長片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的擴增等方面有廣泛而獨特的應用．

參考文獻：

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