桃葉杜鵑菌根顯微結構及侵染情況

歐 靜 ，劉仁陽 ，陳 訓

桃葉杜鵑菌根顯微結構及侵染情況

歐 靜1，劉仁陽1，陳 訓2

(1．貴州大學 林學院，貴州 貴陽 550025；2．貴州省科學院，貴州 貴陽 550001)

采用酸性品紅染色法對貴州不同地域分布的桃葉杜鵑根系染色壓片，對其菌根進行顯微結構及菌根侵染情況觀察。結果表明，野生桃葉杜鵑菌根結構復雜，根外被密集的菌絲包被形成菌絲鞘，無根毛，在菌根中具有杜鵑花類菌根特有典型結構菌絲結，也有穿梭于細胞間的有隔菌絲和束狀菌絲等結構。野生植株菌根侵染指標較高；不同地域的菌根侵染指標差異顯著，貴陽鹿沖關成年開花植株高于百里杜鵑方家坪成年開花植株；不同季節侵染指標兩地春季高于夏季。分布于百里杜鵑的開花成年樹侵染指標明顯低于幼樹。播種苗侵染指標較低，2a播種苗侵染指標較1a呈上升趨勢。

桃葉杜鵑菌根；杜鵑花類菌根；顯微結構；侵染指標

杜鵑花是我們傳統十大名花之一，在國際園藝觀賞植物中占有重要地位[1]。許多杜鵑花生長于土壤貧瘠，晝夜溫差大的惡劣環境，其中菌根起到重要的作用。杜鵑花類菌根（Ericoid Mycorrhiza，ERM），又稱為擬歐石楠類菌根，是杜鵑花科除漿果鵑屬Arbutus、熊果屬Arctostaphylos外植物根系與一些土壤真菌形成典型特征的共生體[2]。國外有較多報道證明ERM對杜鵑花類植物克服惡劣環境、加強吸收養分起到很重要的作用[3-5]，接種菌株能大大提高杜鵑花的生長量[6-7]。我國雖然是杜鵑花的故鄉，但關于ERM的研究卻極少[8-9]。ERM皮層細胞中有不同于其它菌根的特殊結構，即菌絲結（hyphal coil）[2]。據資料，杜鵑花科擬歐石楠Calluna vulgaris 、越橘Vaccinium spp.、北美杜鵑花Rhododendron spp.、彭土杜鵑Rh. ponticum、馬醉木Pieris spp.、石巖杜鵑變種 Rh.obtusum var.Kaempferi、云錦杜鵑Rh. fortunei、銀葉杜鵑Rh.argyrophyllum 、繁花杜鵑Rh. floribundum等植物根系內具有ERM典型結構菌絲結[8-12]。

桃葉杜鵑Rhododendron annae Franch.，分布于我國西南地區,花清雅高潔或艷麗奪目，葉形美觀，樹冠圓滿，花期5～6月，作為園藝觀賞花卉極有開發潛力。近年來高山常綠杜鵑花得到了較多的重視[13-14]，但對桃葉杜鵑的研究報道較少[15-16]。本文對桃葉杜鵑菌根顯微結構及侵染情況進行報道，為桃葉杜鵑菌根化育苗及資源保護與利用提供基礎依據，并對豐富ERM資源有較大意義。

1 材料與方法

1.1 采樣地概況

根樣材料分別采自貴州省貴陽市鹿沖關森林公園桃葉杜鵑模式標本產地和貴州百里杜鵑風景區普底方家坪桃葉杜鵑分布區。鹿沖關桃葉杜鵑產地位于東經 106°43′17″， 北緯 26°38′12″，海拔1 360～1 390 m，山地黃壤土，土層厚度30～80 cm，pH4.8～5.1，種群優勢種為馬尾松Pinus massoniana 和白櫟Quercus fabri ，桃葉杜鵑數量較少，且幾乎為成年樹，幼樹少見；百里杜鵑方家坪桃葉杜鵑分布區位于東經105°53′30″，北緯27°14′51″，海拔 1 800 ～ 1 830 m，硅質黃壤土，土層厚度20～50 cm，pH4.5～5.0，幾乎為桃葉杜鵑純林。

1.2 采樣與試驗方法

實驗樣地20 m×20 m，選擇5株樣本植株進行采集根樣，記錄株高、地徑，鹿沖關菌根樣編號為LCG-T，百里杜鵑方家坪菌根樣編號為BL-T。分別在春、夏兩季定點定樣兩批采樣。3次重復，每重復樣株之間距離100 m以上。1 a、2 a苗取自百里杜鵑風景區杜鵑苗圃，播種基質混有杜鵑林下土壤。樣根均帶土保濕放置于冰桶內帶回實驗室，存放4℃冰箱中備用。

菌根侵染觀測采用酸性品紅染色鏡檢法。步驟采用Komanik P P. 等（1980）方法[17]：洗根-透明-漂洗-軟化-酸化-染色-脫色；隨機取50根段，每根段8 mm左右長，5個一組鏡檢。3次重復。

1.3 侵染記錄與計算

記錄菌根侵染情況，計算侵染指標[18]。侵染分級標準分為0級（侵染比例0%）、1級（侵染比例＜1%）、2 級（侵染比例＜10%）、3級（侵染比例＜50%）、4級（侵染比例＜80%）、5級（侵染比例＞90%）；菌絲結豐富度（豐度）劃分為E0：沒有，E1：很少，E2：較多，E3：豐富。

侵染率F%=受侵染的根段數/觀察的根總段數*100；

整個根系的菌根侵染強度M%=(95n5+70n4+30n3+5n2+n1)/全部根段數(n5表示：5級侵染的根段數；n4表示：4級侵染的根段數，等等)；

侵染根段的菌根侵染強度m%=M*全部根段數/侵染根段數；

侵染根段的菌絲結豐度e%=(100mE3+50mE2+10mE1）/100；mE=((95n5E3+70n4E3+30n3E3+5n2E3+n1E3)/n)*100/m ；

整個根系的菌絲結豐度E%=e*M/100。

1.4 統計分析

使用EXCEL和SPSS軟件進行數據統計分析及作圖。

2 結果與分析

2.1 桃葉杜鵑菌根的形態結構及菌絲體形態

桃葉杜鵑根系由大量細弱如發的側根組成，因此被稱作發根。新生根為乳白色至淡黃色，老根大部分為棕色至深棕色。經過透明染色后，觀察到側根結構簡單，由1層表皮細胞、1-2層皮層細胞和中柱組成，其根部被密集的根外菌絲所包圍，形成菌絲鞘hyphal sheath（又稱為菌套，見圖1.A），無根毛結構。

被真菌侵染的菌根可見細胞增大現象，發根本身結構并未改變。菌根表皮細胞及皮層細胞內可見不同顏色深淺的菌絲，可見ERM特殊結構菌絲結hyphal coil (又稱為菌絲團或菌絲卷，見圖1.BCL）。菌絲結大多在皮層細胞中央分布，有些幾乎充滿整個細胞(見圖1.C）。有些菌根的菌絲結只單獨在一個細胞內分布，而有的真菌菌絲體會穿過細胞進入另一個細胞內。菌絲復合體形態為菌絲群隨意聚集、打結、延伸、反曲(見圖1.DE）。入侵點在生長區與伸長區均有見，入侵菌絲在侵入點附近較細，進入細胞內部后明顯變粗，侵入點的菌絲有單菌絲(見圖1.C，箭頭所示為入侵點）和多菌絲等形式(見圖1.F，箭頭所示為入侵點）。個別根的皮層內觀察到泡囊結構(見圖1.G）。

在桃葉杜鵑根內還發現在側根的分支處可見較多的染色較深的物質積累 (見圖1.H）。穿梭于細胞間的有隔菌絲(見圖1.I，箭頭示隔)和束狀菌絲(見圖1.J)也在樣根中發現。另外，在同一個菌根上觀察到分布于細胞內、細胞間和細胞外的菌絲結構(見圖1.K）。

圖1 桃葉杜鵑側根顯微結構(A,H,K標尺=25 μm;其它標尺=15 μm)Fig.1 Microstructure of hair root of R. annae (A,H,K Bars correspond to 25μm;other Bars correspond to 15μm)

2.2 不同分布地桃葉杜鵑菌根形態結構

從表1可能看出，在不同的分布地，桃葉杜鵑菌根的形態結構有所差異。百里杜鵑分布區的樣根內大多數具有ERM典型結構菌絲結，而在鹿沖關分布區則觀察到更多復雜的菌根結構。

2.3 桃葉杜鵑根系真菌侵染情況

2.3.1 不同分布地野生桃葉杜鵑根系真菌侵染比較

對不同分布地，株高與地徑相近的野生桃葉杜鵑菌根侵染情況測定計算。結果表明，兩地桃葉杜鵑根系均完全形成菌根，侵染率為100%(見表2)。從圖2可以看出，LCG-T菌根春夏兩季其它侵染指標顯著大于BL-T菌根(P＜0.05)。LCG-T1全根系及侵染根系的侵染強度、侵染根系的菌絲結豐度指標分別比BL-T1高出32.64%、10.93%、31.9% 。LCG-T2全根系及侵染根系的侵染強度、侵染根系的菌絲結豐度指標分別比BL-T2高出39.2%、25.77%、44.54%。

表1 不同分布區桃葉杜鵑菌根形態?Table 1 Mycorrhizal morphology of R. annae from different distribution regiongs

表2 桃葉杜鵑菌根侵染率Table 2 Comparison of mycorrhiza infection of R. annae

圖2 不同分布區菌根侵染比較Fig.2 Mycorrhizal colonization in different distribution area

2.3.2 不同季節野生桃葉杜鵑菌根真菌侵染比較

分 析 春 季 (LCG-T1、BL-T1)和 夏 季(LCG-T2、BL-T2)兩地野生桃葉杜鵑根系侵染情況。結果為：在春夏兩季桃葉杜鵑根系均完全形成菌根，侵染率為100%(見表2)；其它侵染指標兩地春季幾乎全部高于夏季(見圖2)。從圖中可以看出，LCG菌根春夏兩季侵染變化小，而BL菌根春夏兩季侵染則變化較大。經方差分析，菌根侵染率受季節影響差異不顯著（P＜0.05）。

2.3.3 成年開花植株與幼樹菌根侵染比較

春季采集于百里杜鵑方家坪成年開花植株菌根(BL-T1)與幼樹（BL-T3)菌根侵染情況測定。結果表明，不論植株高低，野生桃葉杜鵑根系均完全形成菌根，侵染率為100%(見表2）。其它指標BL-T3明顯高于BL-T1菌根，BL-T3根系及侵染根系的侵染強度、菌絲結豐度指標分別比BL-T1高出43.64%、29.47%、53.3% (見圖3）。經方差分析，幼樹與成熟開花樹菌根侵染率差異顯著（P＜0.05）。

圖3 成年開花樹與幼樹菌根侵染比較Fig.3 Mycorrhizal colonization with different standard

2.3.4 播種苗根系菌根侵染情況

1a、2a播種苗的侵染率相對較低，且差異不顯著(見表2）。從圖4中可能看出，1a、2a苗總侵染強度、菌根菌絲結豐度指標很低，但侵染根段的菌絲結豐度相對其它指標高很多，這說明桃葉杜鵑菌根浸染首先形成ERM的潛力很大。2a苗侵染指標較1a呈上升趨勢，侵染根段菌絲結豐度已近50%。

圖4 1a、2a播種苗侵染比較Fig.4 Seedlings colonization of 1a, 2a

3 討 論

3.1 桃葉杜鵑菌根結構

杜鵑花類菌根是一類復雜的菌根[8]，一株植株根系常會結合多種類型菌根菌[19]。吳重華等[20]在冷杉林下的金背杜鵑(Rh. clementinae subsp.aureodorsale)根系中發現了3種與其形成外生菌根的真菌。Vohník和Albrechtová（2011年）對歐洲的六種杜鵑花菌根進行研究，發現它們的根內同時存在有ERM真菌、深色有隔的內生真菌和其它真菌[21]。Setaro等[22]對生長于厄瓜多爾南部熱帶高山雨林的杜鵑花科植物Cavendishia nobilis var. capitata Sebacinales菌根進行了研究，指出其菌根為特殊的內外生菌根，其菌根中的蠟殼耳目(Sebacinales)是一類既能形成菌絲鞘、同時在細胞間穿越和侵入細胞內形成菌絲結結構的真菌。通過染色觀察，發現桃葉杜鵑菌根具有ERM特有的、典型的菌絲結，屬于ERM菌根。但在桃葉杜鵑菌根（主要為LCG-T菌根）中還出現了叢枝菌根（AM）及外生菌根（ECM）具有的一些結構特點，這與賈銳等觀察興安杜鵑菌根的結果相似[23]，但形成這些菌根結構是哪類或哪幾類真菌，還需要進一步研究。

3.2 桃葉杜鵑復雜菌根結構形成的原因

鄭鈺等[7]認為杜鵑花植物菌根形成外生菌根是因為常處于林下層的杜鵑花類植物，通過與外生菌根植物共生的同一種真菌菌絲體整合到森林的公共菌絲體網絡，成為森林內部以公共菌絲體網絡為中介的資源再分配活動的參與者，作者指出這可能對于它們適應多樣的生境具有重要意義。鹿沖關森林公園為桃葉杜鵑模式產地，生物種類繁多，樹林郁閉較高，桃葉杜鵑生長于林下為中下層灌木。桃葉杜鵑復雜的菌根結構由多種真菌侵入引起，可能是維持該物種在復雜環境中生存的一種方式。

有學者認為杜鵑花菌根內同時存在ERM和其它內生菌根的原因是因為分布的緯度與海拔不同[21]。BL-T分布海拔較高，各年齡階段桃葉杜鵑菌根內多見菌絲結結構；LCG-T分布海拔較低，菌根真菌為復雜的菌根結構。從試驗結果來看，兩者之間是有一定差異，但造成分布地菌根結構的差異原因是否因緯度與海拔不同造成，還需要進一步研究。

3.3 桃葉杜鵑菌根真菌的侵染

ERM真菌的侵染受到地域環境的綜合影響[1]，菌根多樣性與地上部分生物的多樣性有相關性[24]。Grime等實驗發現由于菌絲網絡作用，人工小群落中的亞優勢種能夠在優勢種的存在下得以生存，接種后的植物群落比不接種的對照組具有更高的植物多樣性[25]。分布于鹿沖關森林公園的桃葉杜鵑菌根侵染率高，侵染強度大，原因可能與地上部分植被豐富有關，機理可能是通過森林菌根網絡在同種或不同種植物間實現資源的重新分配和共享[26]。分布于百里杜鵑的桃葉杜鵑菌根侵染率及侵染強度稍低可能與其分布區幾乎為純林有關。通過對幼樹菌根觀察，發現菌根幾乎為菌絲體占據，這與金背杜鵑純林菌根侵染率很低的結果有所不同[20]。

幼樹的侵染指標較成年樹高，原因除了菌根能顯著提高根系吸收營養的能力供其生長，還可能是方便幼樹在更大范圍內選擇適合共生真菌[27]。

菌根在不同季節侵染率及侵染強度不同，生態環境條件是主要原因之一。如在西澳大利亞州的南部，由于季節性地中海氣候，杜鵑花菌根真菌明顯活動僅限于較冷濕的月份，在冬天到春天的一段時間菌根的侵染達到了最高[1，28]。桃葉杜鵑菌根侵染是否受到貴州亞熱帶高原季風濕潤氣候的影響需要作進一步的研究。百里杜鵑的桃葉杜鵑菌根春夏季侵染變化較大的原因，可能與生長在高海拔、晝夜溫差大、長時間處于空氣與土壤濕度均較大的環境中有關系。影響侵染率及侵染強度的另外一個原因是植物自身生長發育過程影響。桃葉杜鵑在春季開花，集中花期在5月，開花期需要更多的菌根來吸收營養物質，特別是對磷元素的獲取[29]。桃葉杜鵑春季菌根侵染普遍高于夏季的情況及原因與梅(Prunus mume Sieb. et Zucc.)和蘭(Orchis L. )類似[30-31]。

1a、2a播種苗培養基質中帶有部分原生境真菌，因此播種苗具有一定的侵染，雖然侵染率相對野生較低，但說明桃葉杜鵑人工栽培條件下能形成ERM，這為桃葉杜鵑菌根化育苗提供了事實依據。2a苗侵染指標較1a呈上升趨勢，這可能與ERM真菌選擇、侵染時間和定居時間有關，然而是否與小苗的生長適應性有關需進一步研究。

從試驗結果來看，幼苗—幼樹—成年菌根侵染指標呈現低—高—低的變化趨勢，變化產生的原因及對宿主的影響還需要更多的探索。

致謝：貴州大學生命科學學院江龍教授，林學院謝雙喜教授；1a、2a桃葉杜鵑小苗由百里杜鵑林業局黃家涌提供。

[1] Dixon K W, Sivasithamparam K, Read D J. Ericoid Mycorrhizas in Plant Communities[J].Microorganisms in Plant Conservation and Biodiversity, 2004,227-239.

[2] Read D J.The structure and function of the ericoid mycorrhizal root[J].Annals of Botany,1996,77:365-374.

[3] Cairney J W G.Evolution of mycorrhiza systems[J].Naturwissens chaften,2000,87:467-475.

[4] Cairney J W G,Meharh A A. Ericoid mycorrhizal:A partnership that exploits harsh edaphic conditions[J].European Journal of Soil Science,2003,54:735-740.

[5] Sokolovski S G, Meharg Y A, Maathuis F J M. Calluna vulgaris root cells show increased capacity for amino acid uptake when colonized with the mycorrhizal fungus Hymenoscyphus ericae[J].New Phytologist.2002,155(3):525-530.

[6] Starrett M C,Blazich F A,Shafer S R, et al. In vitro colonization of micropropagated Pieris floribunda by ericoid mycorrhizae.Establishment of mycorrhizae on microshoots[J].Hort Science,2001,36(2):353-356.

[7] Strandberg M,Johannsson M.Uptake of nutrients in Calluna vulgaris seed plants growth with and without mycorrhizae[J].Forest Ecology and Management, 1999,114:129-135.

[8] 張春英,侯奕敏,戴思蘭.云錦杜鵑菌根顯微結構觀察[J].園藝學報,2008,35(11):1641-1646.

[9] 鄭 鈺,高 博,孫立夫,等.銀葉杜鵑和繁花杜鵑根部真菌的多樣性[J].生物多樣性,2010,18(1):76-82.

[10] Ashford A E,Allaway W G, Reed M L. A possible role of Lysinema ciliatum R. Br.＆other Epacridaceae[J].Annals of Botany,1996,77:375-381.

[11] Massicotte H B,Melville L H,Peterson R L.Structural characteristics of root-fungal interactions for five ericaceous species in eastern Canada [J].Canadian Journal of Botany,2005,83:1057-1064.

[12] Usuki F, Junichi A P, Kakishima M.Diversity of ericoid mycorrhizl fungi isolated from hair roots of Rhododendron obtusum var. Kaempferi in a Japanese red pine forest[J].Mycoscience,2003,44:97–102.

[13] 徐小蓉,張習敏,牛曉娟,等.赤霉素+2，4-D及赤霉素+丁酰肼對馬纓杜鵑光合作用日變化的影響[J].中南林業科技大學學報,2011,31(11):131-136.

[14] 李朝嬋,趙云龍,張冬林,等.長蕊杜鵑扦插內源激素變化及解剖結構觀察[J].林業科學研究,2012,25(3):360-365.

[15] 高貴龍,龍秀琴,胡小京,等.赤霉素對兩種高山杜鵑種子發芽的影響[J].種子,2010,29(5):22-25

[16] 苗永美,王永清,莊 平,等.桃葉杜鵑組織培養技術研究[J].生物學雜志,2006,23(6):29-31.

[17] Komanik P P,Bryon W C,Schultz R C. Procedures and equipment for staining large numbers of plant root samples for endomycorrhizal assay[J].Canadian Journal of Microbiology,1980,26(4):536-538.

[18] Trouvelot A, Kough J L, Gianinazzi-Pearson V. Mesure du taux de mycorhization VA d′un système radiculaire.Recherche de méthodes d′estimation ayantune signification fonctionnelle.In:Physiological and Genetical Aspects of Mycorrhizoe,V.Gianinazzi-Pearsin and S.Gianinazzi(eds.).INRA Press, Paris,1986,217-221.

[19] Allen T R,Miller T,Berch S M, et al. Culturing and direct DNA extraction find different fungi from the same ericoid mycorrhizal roots[J].New Phytologist, 2003,160:255-272.

[20] 吳重華,王吉忍,楊俊秀,等.太白山自然保護區金背杜鵑菌根調查研究[J].西北林學院學報,2000,15(3):68-70.

[21] Vohník M and Albrechtová J.The Co-occurrence and Septate Endophytes in Roots of Six European Rhododendron Species,Folia Geobotanica, 2011, 15 March. published online(springer).

[22] Setaro S, Wei? M, Oberwinkler F, et al. Sebacinales form ectendomycorrhizas with Cavendishia nobilis, a member of the Andean clade of Ericaceae, in the mountain rain forest of southern Ecuador[J]. New Phytologist,2006,169: 355–365.

[23] 賈銳,楊秀麗,閆 偉.興安杜鵑菌根形態特征和土壤理化性質的關系研究[J].內蒙古農業大學學報,2011,32(3):63-66.

[24] Peterson T A, Mueller W C, Englander L.Anatomy and ultrastructure of a Rhododendron root fungus association[J].Canadian Journal of Botany,1980,58:2421-2433.

[25] Grime J P,Mackey J M L,Hiller S H,et al. Floristic diversity in a model system using experimental microcosms[J].Nature,1987,328:420-422.

[26] 梁 宇,郭良棟,馬克平.菌根真菌在生態系統中的作用[J].植物生態學報,2002,26(6):739-745

[27] Zettler L W,Pixkin K A,Stewart S I, et al.Protocom mycobionts of the federally threatened eastein prairie fringed orchid,Platanthera leucophaea(Nutt.)Lindley and a technique to prompt leaf elongation in seedlings[J]. Studies in Mycology, 2005,53:163-171.

[28] Kemp E, Adam P,Ashford A E.Seasonal changes in hair roots and mycorrhizal colonization in Woollsia pungens (Cav.) F. Muell.(Epacridaceae) [J].Plant and Soil,2003,250: 241-248.

[29] Dighton J, Coleman D C. Phosphorus relations of roots and mycorrhizas of Rhododendron maximum L. in the southern Appalachians North Carolina[J]. Mycorrhiza,1992,1:175-184.

[30] 蔡邦平,陳俊愉,張啟翔,等.中國梅叢枝菌根侵染的調查研究[J].園藝學報,2008,35(4):599-602.

[31] 侯天文,金 輝,劉紅霞,等.四川黃龍溝優勢蘭科植物菌根真菌多樣性及其季節變化[J].生態學報,2010,30(13):3424-3432.

Study on microstructure and infections of Rhododendron annae mycorrhiza

OU Jing1, LIU Ren-yang1, CHEN Xun2
(1.Forestry College , Guizhou University, Guiyang 550025, Guizhou, China; 2.Guizhou Provincial Dept. of Science and Technology,Guiyang 550001, Guizhou ,China)

By using the acid fuchsin staining, the roots of Rhododendron annae Franch were dyed and squashed, which grows in Guizhou province, and the microstructure and mycorrhizal colonization were observed. The results show that the lateral roots of ferine R. annae have complex structure, were enwrap by dense hypase to form hyphal sheath on the outside of the roots and there was no root hair; There were intracellular hyphal knots which are the unique and typical structure of ericoid mycorrhiza, there also were a few septate hypha and fasciculate hyphae structure. Wild plant infection index was higher, the indexes differences of the infected roots in different regions were remarkable, the indexes of Luchonghuang mycorrhiza of adult flowering plant were higher than Fangjiaping’s; In different seasons, the rates in spring were higher than that in summer; The indexes of flowering adult tree were obviously less than that young tree. Sowing seedlings’ index was lower. The infection indexes of 2-year-old sowing seedlings showed a rising trend compared with that of 1-year-old.

Rhododendron annae mycorrhiza;ericoid mycorrhiza;microstructure;infection index

S718.8

A

1673-923X(2012)11-0028-06

2012-10-10

貴州省農業科技攻關項目(黔科合NY字[2011]3076號)

歐 靜(1974-)，女，貴州威寧人，副教授，主要從事森林培育與種苗培育研究工作， E-mail：coloroj@126.com

陳 訓(1956-)，男，貴州赫章人，研究員，博導，主要從事森林培育與種苗培育研究工作；E-mail:chenxunke1956@163.com

[本文編校：吳 毅]