缺血對胰島素抵抗大鼠Apelin mRNA、APJ mRNA表達的影響

馬芳義 魏芳晶

[摘要] 目的：研究胰島素抵抗（insulin resistance，IR）大鼠心肌Apelin、孤兒G蛋白偶聯受體（APJ）表達及缺血對它的影響。方法：將24只SD大鼠隨機分三組，即IR組、IR+缺血組和對照組，每組8只。采用Real-time-PCR法測定心肌組織Apelin mRNA和APJ mRNA表達水平。結果：IR組Apelin mRNA、APJ mRNA相對表達量較對照組升高，兩組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。IR+缺血組Apelin mRNA、APJ mRNA相對表達量較對照組降低，兩組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：大鼠心肌組織存在Apelin、APJ表達。在胰島素抵抗大鼠中，心肌組織Apelin、APJ代償性表達增加，推測Apelin、APJ可能參與了胰島素抵抗的發生，對心臟發揮保護性作用。胰島素抵抗大鼠心肌缺血后，心肌組織Apelin、APJ表達明顯下降，推測可能與Apelin代償不足或由于腎素-血管緊張素-醛固酮系統激活，反饋性抑制Apelin、APJ表達有關，Apelin、APJ對心臟的保護作用減弱。

[關鍵詞] 缺血；胰島素抵抗；Apelin；APJ

[中圖分類號] R587.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1673-7210（2011）11（c）-027-02

Effects of ischemia on the expression of Apelin mRNA and APJ mRNA in insulin-resistant rats

MA Fangyi1, WEI Fangjing2

1.Department of Cardiology, the Hospital of Bayannaoer City in Inner Mongolia Autonomous Region, Bayannaoer 015000, China; 2.The Health Center of the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical College, Hubbot 010050, China

[Abstract] Objective: To study the expression of Apelin and APJ in the myocardial tissue of insulin-resistant rats and the effects of ischemia on it. Methods: 24 SD rats were randomly divided into three groups, IR group, IR+ischemia group and control group. The expression of APJ mRNA and Apelin mRNA were tested with Real-time PCR method. Results: Compared with the control group, Apelin mRNA relative expression, APJ mRNA relative expression in insulin resistance group increased, there was a significant difference (P<0.05). Compared with the control group, Apelin mRNA relative expression, APJ mRNA relative expression in IR+ischemic group significantly decreased, there was a significant difference (P<0.05). Conclusion: There are the expression of Apelin and APJ in the myocardial tissue of rats. The expression of Apelin and APJ was increased in insulin resistance rats. Apelin and APJ may be involved in the occurrence of insulin resistance to protect the heart. Myocardial Apelin and APJ expression significantly decrease in insulin-resistant rats after myocardial ischemia, suggest that Apelin may be inadequate or the renin-angiotensin-aldosterone system is activated to inhibit the expression of Apelin and APJ, which weaken the protective effect of Apelin and APJ on the heart.

[Key words] Ischemia; Insulin resistant; Apelin; APJ

近年來多項研究已經證明胰島素抵抗（insulin resistance，IR）不僅是動脈粥樣硬化、冠心病發生的獨立危險因素，而且是血脂代謝異常、高尿酸血癥以及肥胖等疾病發生的獨立危險因素。研究發現脂肪因子在IR的發病中發揮很重要的作用，是聯系肥胖和糖尿病及其并發癥的中間環節。新的脂肪因子Apelin是Tatemoto等[1]研究者于1998年采用反向藥理學的研究方法從牛胃的分泌物中提取出來，并純化出的孤兒G蛋白偶聯受體（APJ）的天然配體。APJ（apelin-angiotensin recepor-like）受體之所以被稱為孤兒G蛋白偶聯受體是由于研究者1993年發現APJ時找不到其內源性配體人原因。Apelin通過與其受體APJ結合，對心血管系統發揮著極其重要的調節作用。本研究從基因及蛋白水平尋求缺血、IR與心肌組織Apelin、APJ表達的關系，旨在探討IR大鼠心肌Apelin、APJ表達及缺血對它的影響，為臨床IR的缺血性心血管疾病治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠胰島素ELISA試劑盒：R&D;分裝。鹽酸異丙基腎上腺素購自Sigma公司。Trizol試劑盒購自Invitrogen公司。PCR引物購自生工生物工程（上海）有限公司。M-MLV反轉錄試劑盒購自Takara公司。Real-time PCR擴增試劑盒購自北京澤平生物技術有限公司。100 bp DNA Ladder購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 實驗動物分組及預處理

24只雄性SD大鼠，體重在200 g左右，由北京維通利華實驗動物有限公司提供。將大鼠隨機分三組：IR組、IR+缺血組和對照組，每組各8只。IR、IR+缺血組喂高脂飼料，對照組喂基礎飼料。高脂飼料由北京科奧協力飼料有限公司加工制成。14周后，血糖儀測定空腹血糖（FBG）、ELISA法測定空腹胰島素（Fins）的量，計算胰島素抵抗指數（HOMA-IR指數）＝（FBG×Fins）/22.5，喂高脂飼料大鼠的HOMA-IR指數大于喂基礎飼料大鼠HOMA-IR指數均數加1.96個標準差，則判定其為IR大鼠[2]，判斷IR造模成功后，給IR+缺血組皮下注射異丙基腎上腺素1 mg/（kg·d）體重，連續7 d。其余兩組注射相同體積的生理鹽水。

1.3 觀測指標及實驗方法

1.3.1 心肌組織病理學分析取心肌標本制作石蠟切片，HE染色后觀察形態學改變。

1.3.2 Real-time PCR法測定心肌組織Apelin mRNA、APJ mRNA相對表達量無菌條件下取心肌組織分切，置于-170℃液氮貯存罐中。操作步驟按試劑盒說明進行，實驗步驟：總RNA提取物的獲取、RNA的體外反轉、Real-Time PCR擴增、實時檢測和定量擴增的產物、ΔΔCt相對定量法。

1.4 統計學處理

采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，計量資料數據以均數±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 光鏡下心肌標本觀察（HE染色）

對照組：心肌排列方向整齊，橫紋可見。IR組：心肌細胞萎縮。IR+缺血組：心肌細胞萎縮，間質水腫，部分心肌呈波浪狀、橫紋消失，部分胞漿呈嗜酸性變。見圖1。

2.2 Real-time PCR法定量

IR組Apelin mRNA、APJ mRNA相對表達量高于對照組（P<0.05）；IR組Apelin mRNA、APJ mRNA相對表達量顯著高于IR+缺血組（P<0.05）；IR+缺血組Apelin mRNA、APJ mRNA相對表達量均低于對照組（P<0.05）。見表1。

3 討論

Apelin-APJ系統眾多的生物學效應與Apelin、APJ廣泛的組織分布有關。Apelin既表現出舒張血管的效應，又表現出增強心肌收縮力、減少抗利尿激素的釋放等效應，同時兼有抑制人類免疫缺陷病毒的入侵、促進水的攝入、調整生物節律及垂體激素釋放等生物學效應[3-4]。有研究表明 Apelin由血管內皮細胞產生和釋放，Apelin通過與其受體APJ結合發揮對心肌和血管內皮細胞的保護作用。在心力衰竭以及心肌重塑中Apelin及其受體APJ均有重要的調節作用。心臟和血漿中Apelin的表達在慢性心力衰竭的患者中隨著心力衰竭程度加重而減少[5]。Apelin-APJ信號系統具有一定的拮抗腎素-血管緊張素-醛固酮系統激活的作用。

楊秀紅等[6]用高脂飲食建立了胰島素抵抗大鼠模型，證實了血清胰島素水平是血清Apelin獨立相關因素，機體在胰島素抵抗狀態下，血漿胰島素水平與血漿中Apelin濃度升高呈正相關，這可能與在胰島素抵抗狀態下機體分泌 Apelin增加有關，Apelin、APJ可能作為一種保護性機制而發揮作用。這與本實驗胰島素抵抗大鼠心肌Apelin、APJ表達增加結果相似，Apelin、APJ可能通過拮抗胰島素抵抗對心肌和血管內皮細胞起到保護作用。

Ouwens等[7]研究指出，高脂喂養的大鼠心肌中胰島素信號傳遞途徑中相關信號分子表達異常，從而引起大鼠心肌細胞的胰島素抵抗、心功能低下。隋東虎等[8-9]研究證實在體外循環缺血再灌注機體胰島素抵抗的同時，亦存在明顯的心肌胰島素抵抗現象，其程度隨體外循環時間延長而增強，并與心功能障礙的發生密切相關。本實驗給予異丙基腎上腺素導致胰島素抵抗大鼠心肌缺血，可能進一步引起了其心肌胰島素抵抗，導致心功能障礙，由于Apelin代償不足或者由于Apelin拮抗腎素-血管緊張素-醛固酮系統的作用減弱，導致Apelin、APJ表達明顯下降。因此，改善胰島素抵抗對胰島素抵抗的缺血性心血管疾病極為重要。

[參考文獻]

[1]Tatemoto K, Hosoya M, Habata Y, et al. Isolation and characterization of a novel endogenous peptide ligand for the human APJ receptor [J]. Biochem Biophys Res Commun,1998,251(2):471-476.

[2]陳世偉,張立實,張紅敏,等.大豆異黃酮對胰島素抵抗大鼠胰島素敏感性及瘦素基因表達的影響[J].北京大學學報:醫學版,2006,38(2):197-200.

[3]Ashley EA, Powers J, Chen M, et al. The endogenous peptide apelin potently improves cardiac contractility and reduces cardiac loading in vivo [J]. Cardiovasc Res,2005,65(1):73-82.

[4]Szokodi I, Tavi P, Foldes G, et al. Apelin, the novel endogenous ligand of the orphan receptor APJ, regulates cardiac contractility [J]. Circ Res,2002,91(5):434-440.

[5]Chong KS, Gardner RS, Morton JJ, et al. Plasma concentrations of the novel peptideapelin are decreased in paients with chronic heart failure [J].Eur J Heart Fail,2006,8(4):355-360.

[6]楊秀紅,陳樹春,宋光耀,等.高脂飲食誘導的胰島素抵抗大鼠血清Apelin水平及其脂肪組織Apelin mRNA的表達[J].河北醫藥,2011,33(1):5-7.

[7]Ouwens DM, Boer C, Fodor M, et al. Cardiac dysfunction induced by high-fat diet is associated with altered myocardial insulin signalling in rats [J]. Diabetologia,2005,48(6):1229-1237.

[8]隋東虎,石應康,王儒蓉,等.體外循環缺血-再灌注后心肌胰島素抵抗現象的初步研究[J].中國胸心血管外科臨床雜志,2001,8(1):28-31.

[9]隋東虎,石應康,王儒蓉,等.體外循環缺血-再灌注后心肌胰島素抵抗與心功能障礙的關系[J].中華實驗外科雜志,2002,19(3):208-210.

（收稿日期：2011-08-23）

[作者簡介] 馬芳義（1975-），女，碩士，主治醫師。

[通訊作者] 魏芳晶，心血管博士，碩士生導師。