重組魚腥藻脂肪氧合酶基因的克隆表達、分離純化及活性分析

張充，周孝偉，呂鳳霞，別小妹，陶婷婷，應琦，陸兆新

南京農業大學食品科技學院 酶工程研究室，江蘇 南京 210095

脂肪氧合酶 (Lipoxygenase，LOX) 是一種含非血紅素鐵的蛋白，催化具有順,順-1,4-戊二烯結構的多元不飽和脂肪酸的雙加氧反應，如亞油酸、亞麻酸。脂肪氧合酶廣泛存在于植物、動物[1-2]中，在微生物中鮮有發現。LOX在食品加工中具有重要的應用價值。在面粉加工過程中可催化分子氧對面粉中的具有戊二烯1,4雙鍵的油脂發生氧化，形成的不穩定的氫過氧化物能誘導面筋蛋白質分子聚合，從而起到增強面筋的作用，可以減少或替代強筋劑溴酸鉀的使用[3]。歐美等國家在90年代就有添加大豆粉改善面粉品質的專利出現[4]；同時，近年來，生物合成法外源催化合成風味物質成為一條經濟可行的路線，逐漸被重視，而LOX可以催化生產天然清香味化合物，可以滿足人們對綠色風味物質的追求。

盡管人們早已認識到LOX在食品加工中的潛在應用價值，且LOX在自然界中廣泛存在，但從自然界中直接獲得不僅得率低而且純化難，獲得LOX純酶的成本很高；而使用富含LOX酶的植物材料，如大豆粉，則存在成分復雜、反應不易控制的缺陷，上述原因限制了脂肪氧合酶在食品、化工等領域中的廣泛應用。

通過LOX基因的克隆與表達，經簡單的純化過程，獲得高純度的LOX酶是解決上述問題的極好策略。Casey等[5]提出，重組脂肪氧合酶將成為食品加工領域研究中的前沿。然而，至今為止，還未曾有高效表達脂肪氧合酶的報道[6]。究其原因，一是脂肪氧合酶基因多數來源于真核生物，在原核生物中極少發現，這些基因在原核中 (如大腸桿菌) 表達存在稀有密碼子問題，在真核中 (如酵母) 表達存在糖基化問題；二是LOX基因過長 (2 500~3 000 bp)，也是制約高效表達的一個重要因素。為此，本研究在數據庫中搜索到原核生物魚腥藻PCC 7120基因組中LOX基因以雙功能酶形式存在，利用逐步縮短策略克隆得到其最短的功能基因，進行了定點突變研究，在大腸桿菌中實現高表達，并對重組酶進行了分離純化和性質研究，為該酶在食品加工中的應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

Anabaena sp. PCC 7120菌株購自中國科學院水生生物研究所，Escherichia coli DH5α (△Lac U169 (Φ80 Lac Z △M15) 克隆宿主、E. coli BL21 (DE3) pLysS (F-ompT hsdSB(rB -mB-) gal dcm (DE3) pLysS Camr) 為本實驗室保藏。Escherichia coli表達載體 pET-23a、pET-32a購自Novagen公司，pGS21a購自南京金斯特公司。

限制性內切酶XhoⅠ、SacⅠ、氨芐青霉素、DNA凝膠回收試劑盒、基因組提取試劑盒、DNA marker、瓊脂糖、IPTG購自上海生工生物工程公司。pfu DNA聚合酶、T4 DNA連接酶購自大連寶生物公司；亞油酸購自Sigma公司；其他試劑為國產分析純。

LB培養基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g。加水溶解后，用5 mol/L NaOH將pH調到7.0。加水定容到1 000 mL。配制固體培養基時，按每100 mL加入瓊脂粉1.5 g。

重組大腸桿菌的表達培養基：配制20%葡萄糖，0.075 MPa滅菌20 min，添加至上述LB中，終濃度為0.2%。

1.2 方法

1.2.1 Anabaena sp. PCC 7120脂肪氧合酶基因的搜索

NCBI數據庫 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中輸入“lipoxygenase”對數據庫內的所有基因組信息進行檢索；使用Clustalx軟件進行序列比對分析；使用 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast和http://pfam.sanger.ac.uk網站進行功能預測。

1.2.2 ana-LOX基因的定點突變

運用重疊延伸PCR (over-lap extension PCR，SOE-PCR) 技術[7]，設計2個PCR反應以產生2個含突變位點的DNA片段，分別用引物L-F、L-R和R-F、R-R擴增含有突變位點的上游片段L和下游片段R，隨后將上述兩個PCR產物混合，二者通過末端互補區結合并在適宜的溫度下互為引物延伸得到完整的含突變的基因。突變位點選擇是根據序列分析預測出活性位點，分別為His197、His202、His369、Asn373和 Ile455，并且隨機選擇了His364、Asn419和Ile326作為活性中心位點的佐證。表1為ana-LOX基因定點突變引物及突變方向。

表1 定點突變用引物Table 1 Synthetic primers for site-direct mutation

?

1.2.3 Anabaena sp. PCC 7120脂肪氧合酶功能基因的克隆

參考GenBank中Anabaena sp. PCC 7120基因組序列[8](Accession No. NC_003267)，利用DNAMAN軟件設計只編碼脂肪氧合酶功能序列的引物。

Ana-LOX含有 5個保守活性位點，只有 5個活性位點均存在才具有活性。因此，將當N端邊緣氨基酸為保守殘基時的基因長度設定為最短基因長度，將已經證明具有活性的ana-LOX基因長度設定為最長基因長度。采用分別截取，逐步測定基因活性，最終精確到一個三聯體長度的差別，方案如圖1所示。表2為鑒定ana-LOX基因功能基因長度的引物。

1.2.4 大腸桿菌ana-LOX基因重組表達載體的構建

凝膠回收的 PCR產物以及表達載體pET-23a、pET-32a和 pGS21a-ana-LOX分別用BamHⅠ酶切處理，再分別凝膠回收純化，用T4 DNA連接酶置于16 ℃連接過夜后，全部轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞。涂布于含有氨芐青霉素的LB平板，倒置，37 ℃培養過夜。挑取單菌落于10 mL LB液體培養基，37 ℃、200 r/min振蕩10 h，小量提取質粒。電泳鑒定重組子。送上海生工生物工程有限公司測序。獲得重組表達載體 pET-23a-ana-LOX、 pET-32a-ana-LOX、pGS21a-ana-LOX。

圖1 逐步縮短基因長度策略Fig. 1 Strategy for shortening the ana-LOX gene.

表2 Ana-LOX基因縮短用引物Table 2 Synthetic primers for shortening ana-LOX gene

1.2.5 目的基因在大腸桿菌中的誘導表達

分別挑取含有重組表達載體 pET-23aana-LOX、pET-32a-ana-LOX、pGS21a-ana-LOX的重組菌和對照菌E. coli BL-21 (DE3) 以及含空載體的對照菌體，接種于含有100 mg/L氨芐青霉素的液體 LB培養基中，37 ℃、180 r/min培養14 h。再分別取8 mL種子液到500 mL 三角瓶中，加入100 mL上述LB培養基液體培養基，37 ℃、180 r/min 培養至OD600為0.6左右，加IPTG至100 mg/L，37 ℃、180 r/min誘導5 h或者低溫16 ℃誘導15 h，4℃、10 000×g離心5 min，收集菌體。

1.2.6 SDS-PAGE分析

SDS-PAGE電泳參照 Lorenzi等[1]報道的方法進行，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為10%，膠厚 1.0 mm。電泳完畢后，取出凝膠，固定、考馬斯亮藍R-250染色、脫色后觀察并拍照。

1.2.7 重組脂肪氧合酶的分離純化

將誘導表達收集到的菌體，用磷酸緩沖液(50 mmol/L PBS+0.3 mol/L NaCl+0.5% Triton X-100) 重懸菌體，超聲波破碎菌體 (400 W，超聲5 s，間歇10 s，共超聲15 min)，4 ℃、10 000×g離心10 min，收集上清液作為粗酶液。

將處理得到的粗酶液按照 Ni-NTA His Tag Kit說明書依次用含不同濃度咪唑 (50 mmol/L、100 mmol/L、150 mmol/L、200 mmol/L) 的洗脫液洗脫Ni-NTA柱，收集洗脫峰，測定脂肪氧合酶活性。

1.2.8 酶活力測定

脂肪氧合酶活性分析用亞油酸鈉作為底物。酶反應體系中含有：pH 6.0的磷酸緩沖液2.79 mL，酶液10 μL，亞油酸鈉200 μL，混勻后放入35 ℃水浴中并開始計時，反應3 min后測定吸光度[9]。酶活單位定義：在上述條件下以1 min內3 mL反應體系在234 nm的吸光度增加0.001作為一個酶活力單位U[10]。

1.2.9 重組脂肪氧合酶酶學性質的研究

重組脂肪氧合酶的最適反應溫度：將緩沖液分別在20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃水浴中保溫10 min，加入10 μL待測酶液，在不同溫度下反應3 min，在234 nm下測定吸光值，以不加酶的溶液作對照。以溫度為橫坐標，酶活力為縱坐標作圖，得到該酶的最適反應溫度。

重組脂肪氧合酶的熱穩定性：將待測酶液(溶在0.2 mol/L pH 6.0 PBS緩沖液中) 分別在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃水浴中保溫1 h，每隔10 min取出一組樣品，迅速置于冰水中，待保溫結束后統一進行酶活力測定，以未處理酶液作為對照。以溫度為橫坐標，酶活力為縱坐標，得到溫度對酶活力的影響曲線。

重組脂肪氧合酶的最適pH值：以亞油酸鈉為底物，在pH分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的緩沖液中，按酶活力測定方法中所述，進行酶活測定。

重組脂肪氧合酶的pH穩定性：將重組脂肪氧合酶在不同pH值的緩沖液中，30 ℃保溫1 h，測定剩余的酶活力。

重組金屬離子對酶活性影響：將各種金屬離子與酶液混合，使其最終濃度達到10 mmol/L，然后在30 ℃下測定酶活，均以不加金屬離子的酶液為空白對照組，以未處理的酶液的酶活為100%。

2 結果與分析

2.1 Anabaena sp. PCC 7120脂肪氧合酶基因的序列分析

在 NCBI數據庫 (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/) 中搜索到了Anabaena sp. PCC 7120脂肪氧合酶酶基因與丙二烯氧合酶以雙功能酶(AOS-LOX，NC_003267) 形式存在，LOX活性中心位于雙功能酶C端。將AOS-LOX的C端覆蓋 LOX活性位點的 455氨基酸輸入http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast網站，發現該段序列屬于脂肪氧合酶家族。將該段455氨基酸序列輸入http://pfam.sanger.ac.uk網站，分析該段序列的二級結構的保守模塊，發現該段序列中含有脂肪氧合酶保守功能模塊。將該段序列與其他來源的LOX進行氨基酸序列比對[11-14]，找到了LOX活性中心定位鐵離子的5個保守氨基酸殘基位點分別為His197、His202、His369、Asn373和Ile455。

2.2 Ana-LOX基因的克隆及其在大腸桿菌中的誘導表達

參考GenBank中Anabaena sp. PCC 7120基因組序列 (Accession No. NC_003267)，利用DNAMAN軟件設計了擴增雙功能酶C端455氨基酸殘基基因序列 (1 368 bp) 的引物：上游引物：5′-CGCGA GCTCGGAGTGTCTGGTGCC-3′；下游引物：5′-CCGCTCGAGCTAAATGTTGATA CTCATCAT-3′。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后，可見1 368 bp處的片段。以構建的重組質粒 pET-23a- ana-LOX、pET-32a-ana-LOX、pGS21a-ana-LOX進行 BamHⅠ酶切后瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結果得到長約1 368 bp的片段，酶切結果與預期目標一致。測序結果與 GenBank公布的序列一致，證實重組質粒構建成功。

將3個重組表達載體轉化E. coli BL21 (DE3) pLysS表達宿主菌，篩選獲得的重組子通過IPTG的誘導作用，均獲得了ana-LOX的活性表達，酶活測定結果如圖 2所示。其中 pET-32aana-LOX的活性表達最高，并且16 ℃低溫條件下誘導表達獲得的酶活性均高于30 ℃條件下的表達結果。

因此，選取了帶有分子伴侶 Trx的pET-32a-ana-LOX的重組表達載體進行下一步研究。當IPTG濃度為1 g/L，誘導時間16 h，誘導時機 OD600為 0.8，誘導溫度為 16 ℃的培養條件下，重組脂肪氧合酶活力可達(6 750±40) U/mL。

圖2 Ana-LOX E. coli工程菌在16 ℃和30 ℃條件下誘導表達酶活測定Fig. 2 Production of active recombinant ana-LOX in recombinant E. coli at 16 °C and 30 °C condition.

2.3 Ana-LOX基因的定點突變

定點突變酶基因的克隆采用SOE-PCR的方法，各個突變基因與表達載體連接酶切驗證并測序正確后，采用熱激法將重組表達載體轉化入E. coli BL21 (DE3) pLysS，酶活測定結果見表3。 His197、His202、His369、Asn373、Ile455位點的所有突變基因均無活性，而隨機選擇His364、Asn419、Asn326位點的所有突變基因均維持原有活性，證明His197、His202、His369、Asn373、Ile4555個氨基酸殘基位點為ana-LOX活性中心的保守位點。

表3 定點突變基因活性測定Table 3 Activity of site-directed mutation

2.4 Ana-LOX功能基因的長度

不同長度的 ana-LOX基因與表達載體pET-32a連接，獲得工程菌誘導發酵后，酶活結果見表4。1 368~1 254 bp長度的ana-LOX基因酶活基本一致，1 254~1 233 bp長度的ana-LOX基因酶活逐步開始降低，當ana-LOX基因長度縮短為 1 230 bp時，酶活完全喪失。因此，ana-LOX的最適基因片段長度為1 254 bp，重組脂肪氧合酶的分離純化及性質研究選擇均選擇1 254 bp進行研究。

2.5 重組ana-LOX蛋白表達形式鑒定

分別取適量 pET-32a-ana-LOX工程菌及含空載體的對照菌體，誘導發酵超聲波破碎菌并離心后，上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳。結果如圖3所示，重組蛋白全部以可溶性形式存在于細胞裂解物的上清中。

2.6 重組ana-LOX分離純化

按照Ni-NTA His Tag Kit說明書，依次用含不同濃度咪唑 (50 mmol/L、100 mmol/L、150 mmol/L、200 mmol/L) 的洗脫液洗脫Ni-NTA柱，收集洗脫峰，測定脂肪氧合酶活性。結果如表 5所示，當咪唑為 150 mmol/L時，通過 Ni-NTA層析一步純化，比活達到11.4×104U/mg蛋白，純化倍數達到23倍，酶活回收率為 60.89%。如圖 4所示，對純化重組酶進行 SDS-PAGE檢測，結果顯示純化效果較好。

表4 不同基因長度的ana-LOX活性測定Table 4 Activity of ana-LOX with different gene length

表5 Ni-NTA層析柱純化重組蛋白Table 5 Purification of recombinant His6-ana-LOX

純化后的融合蛋白在 SDS-PAGE中顯示為一條帶 (圖 5)。泳道 1為重組的融合蛋白Trx-ana-LOX，用Bio-Rad Quantity One 4.6.2凝膠分析軟件計算其分子量約為70 kDa左右，與理論值基本一致。

2.7 重組ana-LOX的性質研究

2.7.1 重組酶反應的最適pH

將純化的重組酶在不同的pH條件下與底物反應后，測定各條件下的活力。不同pH值對重組脂肪氧合酶活力的影響。如圖5所示，重組脂肪氧合酶反應的最適pH值為6.0。

2.7.2 重組酶反應的最適溫度

將純化的重組酶在不同的溫度條件下與底物反應后，測定各條件下的活力。結果表明重組酶的最佳反應溫度為45 ℃ (圖6)。

2.7.3 重組酶的熱穩定性

對重組ana-LOX的熱穩定性進行了研究。如圖7所示，在20 ℃條件下保溫1 h，酶活降低到對照組的83%，30 ℃條件保溫25 min，酶活降低為對照組的50%，40 ℃和50 ℃條件下酶的較易失活，保溫10 min后酶活分別降低為對照組的50%和40%。

圖3 SDS-PAGE鑒定重組蛋白的表達形式Fig. 3 SDS-PAGE analysis of the solubility of expressed protein. 1: the crude extracts from cells carrying pET-32a (control); 2: the supernatant of the disrupted cells carrying pET-32a-ana-LOX, recombinant Trx-ana-LOX is indicated by arrowhead; 3: inclusion bodies of cells carrying pET-32a-ana-LOX; M: protein marker.

圖4 純化后重組ana-LOX SDS-PAGE電泳Fig. 4 SDS-PAGE analysis of purified recombinant ana-LOX.

2.7.4 金屬離子對重組酶活性的影響

金屬離子對酶活的影響見表 6。其中 Fe2+對重組ana-LOX具有強烈的激活作用，與對照組相比，能提高到 181.91%，Fe3+和 Cu2+對重組 ana-LOX有強烈的抑制作用，能完全抑制ana-LOX活性。Mg2+和Ca2+對重組ana-LOX具有一定激活作用；Na+、Zn2+和 Mn2+對重組ana-LOX具有一定的抑制作用。

圖5 pH對重組酶的活力的影響Fig. 5 Effect of pH on recombinant ana-LOX activity.

圖6 溫度對重組酶活力的影響Fig. 6 Effect of temperature on recombinant ana-LOX activity.

圖7 Ana-LOX熱穩定性Fig. 7 Thermal stability of recombinant ana-LOX.

表6 金屬離子對重組ana-LOX活性的影響Table 6 Effect of metal ions (10 mmol/L) on recombinant ana-LOX

2.8 重組Ana-LOX對面團微觀結構的影響

圖8分別為對照面團 (A)、每克面粉添加80 U (80 U/g) 重組 Ana-LOX處理的面團 (B)和每克面粉添加添加50 μg KBrO3(50 μg/g) (C)處理的面團在500倍放大倍數下的SEM顯微結構圖片。結果表明，與對照組比較 (A)，經重組Ana-LOX處理后的面團結構的變化明顯，可以清晰地看到少量絲狀結構變成完整的網狀結構，而淀粉顆粒則存在于交錯的面筋網絡之間 (B)，與KBrO3處理所得結果基本相似 (C)。重組Ana-LOX在改善面團結構方面表現出了良好的效果，有待進一步研究。

圖8 面團的SEM顯微結構圖Fig.8 SEM results of the dough with no enzyme treatment. (A) Control. (B) With 80 U/g dough ana-LOX treated. (C) With 50 μg/g dough KBrO3 treated.

3 討論

關于脂肪氧合酶的異源表達早有學者開始研究。分別對氰細菌、水稻、大豆等多種[6,12-15]來源的LOX基因在大腸桿菌中進行了異源表達研究，但活性表達量都很低。LOX基因至今表達量不高主要由于多數來源于真核生物，異源表達過程中存在基因長度過長、稀有密碼子以及翻譯后加工修飾等問題。因此，尋找新型原核來源的LOX基因，對于開發LOX成為新型食品添加劑具有重要的意義。

本研究通過在 NCBI數據庫中搜索，發現Anabaena sp. PCC 7120基因組中含有LOX基因，以雙功能酶形式存在。通過氨基酸序列比對和活性位點的推測發現LOX活性中心為雙功能酶的C端，并從C端擴增了一段只包含脂肪氧合酶活性中心的基因 (ana-LOX)。雖然與其他來源的LOX同源性很低 (表7)，但是，保守區、二級結構域以及三維結構預測均發現擴增得到的ana-LOX基因屬于LOX家族。由于ana-LOX基因具有原核來源、基因長度 (1 368 bp) 比其他來源的基因小許多，因此，具有實現LOX高效異源表達的潛力。

本研究結果表明，擴增的ana-LOX在E. coli中獲得了活性表達，酶活達到 6 750 U/mL。Ana-LOX基因在不同的表達載體表現出不同的酶活產量，表明分子伴侶能夠影響重組ana-LOX的活性表達量，分子伴侶Trx優于GST。低溫發酵能夠避免包涵體的形成[16]，在16 ℃條件下，重組ana-LOX全部以可溶性形式出現，該結果屬首次報道。通過Ni柱一步純化過程，獲得了電泳純的重組蛋白條帶，對重組ana-LOX酶學性質進行了研究的。金屬離子能夠影響酶活性，Fe2+能夠顯著提高重組ana-LOX酶活，而Cu2+和Fe3+能夠完全抑制重組ana-LOX酶活。我們分析金屬離子的氧化性質影響到重組ana-LOX Fe原子的價態變化從而影響到酶活。

大豆 LOX-1的空間結構已被解析，活性保守位點即Fe3+定位殘基為His499、His504、His690、Asn694和 Ile839[13]。通過序列比對和空間結構模擬，我們預測到ana-LOX的保守位點為His197、His202、His369、Asn373和Ile455。LOX的氧化活性是通過的 Fe3+價態的變換實現的[15]，因此定位Fe3+的氨基酸殘基會通過電子間的競爭影響LOX的活性。為了提高LOX的活性，采用定點突變技術進行了定向進化研究。然而通過將保守位點分別突變為中性、堿性、酸性氨基酸，獲得的突變基因在E. coli均為無活性表達。Mirela等在研究Mn脂肪氧合酶過程中，定點突變后發現突變基因表達出的重組酶喪失了活性，進一步研究發現突變重組酶檢測不到 Mn離子[17]。因此，推測ana-LOX保守位點的突變也同樣導致了Fe3+無法定位。通過大量的定點突變，沒有得到活性提高的突變基因，但是，該結果證明了ana-LOX保守氨基酸位點確實與預測的一致。為了對該結論加以佐證，我們隨機選擇了其他位點的相同氨基酸進行突變，突變基因表達出的重組ana-LOX均具有活性。今后的工作可以在此基礎上，對活性中心位點周邊的殘基進行突變，以期獲得性能改良的突變酶。

表7 ana-LOX與其他來源LOX序列同源性Table 7 Identity of ana-LOX to other resource of LOX

通過信息學分析，以及定點突變研究，位于ana-LOX C末端的Ile是活性中心不可缺少的氨基酸殘基。同理，我們考慮ana-LOX N端也應該存在一個過渡區域，決定了ana-LOX基因的最短長度。通過從ana-LOX基因5￠端逐步縮短基因長度，首次發現ana-LOX基因長度存在一個過渡區域，即當基因長度長于1 254 bp時，表達的重組LOX活性處于同一水平，當基因長度縮短為1 254 bp時，重組酶活逐步降低，至1 230 bp時，酶活消失。我們分析 C端的氨基酸在維持重組ana-LOX空間結構的穩定性發揮一定作用。當維持空間結構起主要作用的殘基消失，活性結構處于不穩定狀態，或者無法形成活性結構。

對不同來源的脂肪氧合酶的性質，國內外學者也有不少報道。Danield等[18]以酪梨為材料分離純化LOX，發現其最適反應pH為6.5，最適反應溫度為 40 ℃；Jin等[19]的研究結果表明，豌豆種子的最適反應pH為9.0，最適反應溫度為39 ℃；陳書婷等[20]對大豆LOX進行了研究，發現其最適反應pH為9.0，在低溫下 (低于40 ℃)保持較高酶活性。本研究中表達的重組ana-LOX最適反應pH為6.0，表明為一種偏酸性酶；最適反應溫度為45 ℃，高于其他來源的LOX，有利于在實際生產加工過程中的應用。

本研究實現了ana-LOX的高效表達，顯示出ana-LOX基因在食品酶制劑中的巨大應用潛力。但是作為宿主的E. coli屬于致病菌，屬于胞內表達，獲得重組蛋白必須經過破壁，且需要嚴格的純化過程以除去致病物質才能應用于人體。而對于附加值較低的食品添加劑用酶，高額的純化成本必然會限制其應用。因此，需要尋找安全的表達系統，實現胞外分泌表達。有關ana-LOX食品級表達系統的構建是我們進一步研究的重點方向。

[1] Lorenzi V, Maury J, Casanova J, et al. Purification, product characterization and kinetic properties of lipoxygenase from olive fruit (Olea europaea L.). Plant Physiol Biochem, 2006, 44(7/9): 450?454.

[2] Kuo JM, Hwang A, Yeh DB, et al. Lipoxygenase from banana leaf: purification and characterization of an enzyme that catalyzes linoleic acid oxygenation at the 9-position. J Agric Food Chem, 2006, 54(8): 3151?3156.

[3] Zhang SW, Li D. Improve wheat flour quality by biological technology. J Chin Cereals Oils Assoc, 2002, 17(1): 16?21.張守文, 李丹. 應用混合酶制劑進行面粉品質改良的基礎研究. 中國糧油學報, 2002, 17(1): 16?21.

[4] Addo K, Burton D, Stuart MR, et al. Soybean flour lipoxygenase isozyme mutant effects on bread dough volatiles. J Food Sci, 2006, 3(58): 583?585. [5] Casey R, West SI, Hardy D, Robinson DS, et al. New frontiers in food enzymology: recombinant lipoxygenases. Trends Food Sci Tech, 1999, 10(9): 297?302.

[6] Koeduka T, Kajiwara T, Matsui K. Cloning of lipoxygenase genes from a cyanobacterium, Nostoc punctiforme, and its expression in Eschelichia coli. Curr Microbiol, 2007, 54(4): 315?319.

[7] Nakamura A, Takakura Y, Kobayashi H, et al. In vivo directed evolution for thermostabilization of Escherichia coli hygromycin B phosphotransferase and the use of the gene as a selection marker in the host-vector system of Thermus thermophilus. J Biosci Bioeng, 2005, 100(2): 158?163.

[8] Kaneko T, Nakamura Y, Wolk CP, et al. Complete genomic sequence of the filamentous nitrogenfixing cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120. DNA Res, 2001, 8(5): 205?213.

[9] Hou ML, Miao HR, Chen J, et al. Measurement of peanut seeds lipoxygenase activity. J Anhui Agric Sci, 2008, 36(32): 14033?14035.侯美玲, 苗華榮, 陳靜, 等. 花生種子脂肪氧化酶的活性測定研究. 安徽農業科學, 2008, 36(32): 14033?14035.

[10] Szymanowska U, Jakubczyk A, Baraniak B, et al. Characterisation of lipoxygenase from pea seeds (Pisum sativum var. Telephone L.). Food Chem, 2009, 116(4): 906?910.

[11] Oldham ML, Brash AR, Newcomer ME. Insights from the X-ray crystal structure of coral 8R-lipoxygenase. J Biol Chem, 2005, 280(47): 39545?39552.

[12] Wang R, Shen WB, Liu LL, et al. A novel lipoxygenase gene from developing rice seeds confers dual position specificity and responds to wounding and insect attack. Plant Mol Bio, 2008, 66(4): 401?414.

[13] Meyer MP, Tomchick DR, Klinman JP. Enzyme structure and dynamics affect hydrogen tunneling: The impact of a remote side chain (I553) in soybean lipoxygenase-1. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105(4): 1146?1151.

[14] Shin JH, Van K, Kim DH, et al. The lipoxygenase gene family: a genomic fossil of shared polyploidy between Glycine max and Medicago truncatula. BMC Plant Biol, 2008, 8(1): 133.

[15] Sellhorn GE, Youn B, Webb B, et al. Biochemical characterization, kinetic analysis and molecular modeling of recombinant vegetative lipoxygenases from soybean. Int J Bio, 2011, 3(1): 44?62.

[16] Fang JJ, Ewald D. Expression cloned cDNA for 10-deacetylbaccatin III-10-O-acetyltransferase in Escherichia coli: a comparative study of three fusion systems. Protein Expr Purif, 2004, 35(1): 17?24.

[17] Cristea M, Engstr?m ?, Su C, et al. Expression of manganese lipoxygenase in Pichia pastoris and site-directed mutagenesis of putative metal ligands. Arch Biochem Biophy, 2005, 434(1): 201?211.

[18] Jacobo-Velázquez DA, Hernández-Brenes C, Cisneros-Zevallos L, et al. Partial purification and enzymatic characterization of avocado (Persea americana Mill, cv. Hass) lipoxygenase. Food Res Int, 2010, 43(4): 1079?1085.

[19] Jin GF, Zhang JH, Yu X, et al. Crude lipoxygenase from pig muscle: partial characterization and interactions of temperature, NaCl and pH on its activity. Meat Sci, 2011, 87(3): 257?263.

[20] Chen ST, Kong XZ, Hua YF, et al. Study on purification and some properties of soybean lipoxygenase. Sci Technol Food Ind, 2011(5): 176?182.陳書婷, 孔祥珍, 華欲飛, 等. 大豆脂肪氧合酶的分離純化及其性質研究. 食品工業科技, 2011(5): 176?182.