高效液相色譜法同時測定水產品中氨基甲酸酯類的殘留

洪 波 萬譯文 劉伶俐 劉 麗

（湖南省水產科學研究所，湖南 長沙 410153）

氨基甲酸酯類農藥是一類廣譜性農藥，在農作物栽培過程中，特別是在種子處理上，氨基甲酸酯類殺蟲劑得到廣泛的應用。然而，當此類物質進入到水體后會在魚體和其它水生生物體內富集，被認為是對養殖環境和人類有害的藥物，因此很有必要加強對水產品中該類物質的監測。

目前中國還沒有制定相應的水產品檢測國家標準，據報道的關于動植物源性食品中氨基甲酸酯類農藥的測定方法有氣相色譜法［1］、氣相色譜／質譜聯用法（GC／MS）［2］、高效液相色譜法［3－5］、超臨界流體色譜法［6，7］、高效液相 色 譜－串聯質譜法［8，9］。在采用凝膠滲透 凈 化技術［10］凈化樣品，以高效液相色譜法－紫外檢測器檢測過程中發現，凝膠滲透凈化技術能分離大分子類干擾雜質，但用在水產品檢測上存在分離不完全和溶劑用量大的缺陷。本試驗采用丙酮／二氯甲烷提取水產品試樣，提取液經濃縮后，采用固相萃取技術進行凈化處理再濃縮定容，樣品使用帶紫外檢測器的高效液相色譜進行檢測，以期為水產品中氨基甲酸酯類農藥多組分殘留的實驗室檢測方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑、儀器與供試樣品

1.1.1 試劑

丙酮、二氯甲烷、甲醇：色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司；

乙腈：色譜純，美國Tedia公司；

氯化鈉：優級純，天津市科密歐化學試劑有限公司；

磷酸：分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；

甲醇－二氯甲烷（V／V ＝5／95）：天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器

高效液相色譜儀（配紫外檢測器）：Waters2489，美國Waters公司；

旋轉蒸發器：RE－52AA，上海亞榮生化儀器廠；

高速冷凍離心機：Z323K，德國Hemel公司；

超聲波清洗器：KQ5200DE，昆山超聲波儀器廠；

氨基固相萃取柱：500mg／6mL，美國Varian公司。

1.1.3 供試樣品

草魚、對蝦、鱈魚：均為無公害檢測的陰性樣，市售。

1.2 標準溶液配置

1.2.1 標準儲備液的配制 分別稱取涕滅威、甲萘威、克百威各5mg，速滅威、異丙威各10 mg，用甲醇溶解并定容至10.0mL，冰箱－18 ℃保存。涕滅威、甲萘威、克百威溶液濃度5g／L，速滅威、異丙威溶液濃度10g／L。

1.2.2 混合標準溶液的配制 分別吸取1.2.1中標準溶液各2.0mL置于10mL容量瓶中，加流動相至刻度。此溶液含涕滅威、甲萘威、克百威各1.00 mg／L，速滅威、異丙威各2.00mg／L。

1.3 樣品處理

準確稱取20.00g搗碎、混勻的樣品于100 mL 具塞塑料離心管中，加入5g無水硫酸鈉和混合提取液（25mL丙酮＋25mL二氯甲烷＋200μL 磷酸），均質1min，加入6g氯化鈉，超聲提取10 min，5 000r／min離心10 min，取25 mL提取液到雞心瓶中旋轉蒸發濃縮至干，加入2mL 乙腈溶解殘渣，待過柱。

用乙腈活化氨基固相萃取柱，轉移提取液到柱上，然后在雞心瓶中加入2mL乙腈重復清洗1次，一并轉移到柱上。繼續用5mL 乙腈清洗柱子，最后用4mL 的甲醇－二氯甲烷溶液洗脫，收集洗脫液用40 ℃氮吹干。用流動相溶解殘渣，并定容到1mL，過0.45μm 濾膜供液相色譜測定。

1.4 色譜條件

色譜柱：Waters ODS－C18柱（250mm×4.6mm，5μm），柱溫35 ℃，進樣量20μL，流動相：甲醇＋水＝50＋50，流速、吸收波長時間變化（見表1）。

2 結果與討論

2.1 提取液的選擇

參照文獻［4］、［11］和［12］，分別對不同提取液（①25mL乙腈；②25mL乙腈＋200μL磷酸；③25mL甲醇；④25mL丙酮＋25mL二氯甲烷＋200μL磷酸）進行試驗。試驗結果表明：用提取液①進行提取時干擾物質會大量富集在提取液中且難以除去；用提取液③進行提取時同樣會有干擾物過多的富集且涕滅威、異丙威回收率僅在30.50%～46.20%；用提取液②進行提取時雖減少了富集問題卻出現速滅威的回收率很低的情況；而選擇提取液④對分析無干擾，且提取效果好，回收率均在62.40%以上，故而選擇25 mL 丙酮＋25mL二氯甲烷＋200μL磷酸進行后續試驗。

表1 流速、吸收波長時間變化表Table 1 Velocity，absorption wavelength change of time table

2.2 凈化方式的選擇

經凝膠層析柱凈化和氨基固相萃取柱凈化方式的比對試驗，并參考加速溶劑萃取方法［3］和超臨界流體萃取方法［6］。試驗發現：采用磷酸沉淀蛋白后，使用氨基固相萃取小柱（圖1）對提取液進行凈化和濃縮的效果與GB／T 5009.163——2003凈化方式（圖2）相比較，固相萃取凈化方式具有節省時間、溶劑用量少、不易乳化等特點。氨基固相萃取柱對氨基甲酸酯類農藥幾乎沒有保留，通過固相柱后，可有效除去樣品的雜質干擾物，從而起到更好凈化的效果。

2.3 最大吸收波長的選擇

試驗使用5種氨基甲酸酯混合標準工作溶液，在紫外吸收 區域選取了吸收波長為190，195，200，205，210，220，250nm的7個點，分別進行進樣分析，記錄5種氨基甲酸酯的在不同吸收波長下的峰面積見表2。結果表明：在195nm波長時（圖3）涕滅威、速滅威、克百威、異丙威有最大的吸收峰，而甲萘威的最大吸收波長為220nm（圖4）。以此，最終選用樣品分析時及時變換195，220nm（圖5）兩個吸收波長來對樣品進行測定。

圖1 氨基固相萃取柱凈化分析色譜圖Figure 1 SPE chromatography purification of amino analysis diagram

圖2 凝膠層析柱凈化分析色譜圖Figure 2 Gel chromatography purification of amino analysis diagram

2.4 線性范圍和最低檢出限

分別吸取1.2.2中溶液0.50，1.00，5.00，10.0mL置于10mL容量瓶中，用流動相定容，溶液中涕滅威、甲萘威、克百威的濃度各為0.05，0.10，0.50，1.00，2.00μg／mL，速滅威、異丙威的濃度各為0.10，0.20，1.00，2.00，4.00μg／mL，等體積進樣進行分析檢測，繪制標準曲線，結果表明：在上述濃度范圍內，峰面積與溶液濃度呈良好的線性關系，線性方程與相關系數見表3。

表2 5種氨基甲酸酯的在不同吸收波長下的峰面積Table 2 5kinds of carbamate in different absorption wavelength of peak area

圖3 195nm 時5種氨基甲酸酯分析圖譜Figure 3 195nm 5carbamate analysis map

圖4 220nm 時5種氨基甲酸酯分析圖譜Figure 4 220nm 5carbamate analysis map

圖5 變波長時5種氨基甲酸酯分析圖譜Figure 5 Variable wavelength of 5carbamate analysis map

表3 5種氨基甲酸酯線性范圍和最低檢出限Table 3 5kinds of carbamate linear range and detection limit

2.5 方法回收率

在魚糜樣品中分別加入濃度為0.20，1.00μg／mL 的5種氨基甲酸酯農藥的混合標準溶液進行方法回收率試驗。由表4 可知，5 種氨基甲酸酯農藥的加標平均回收率在62.40%～90.25%，相對標準偏差均在1.46%～9.32%，5種氨基甲酸酯回收率都很高，而且重復性和可現性都很好，其中涕滅威的平均回收率最高，達90.25%。

3 結論

本方法是在文獻［13］、［14］的基礎上，從改變吸收波長降低檢出限方面進行改進。但使用變波長會使基線產生一定波動，所以要求樣品中各組分之間要一定的保留時間差。后續研究考慮將梯度洗脫方法運用于此樣品分析中，期望可以得到更好的分離效果和縮短分析時間。

表4 5種氨基甲酸酯回收率Table 4 5kinds of carbamate recycle rate

1 陳霞，張雪梅，楊華梅，等.凝膠滲透色譜－氣相色譜法測定蔬菜中24種有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留［J］.中國衛生檢驗雜志，2009，19（1）：75～76.

2 邊照陽，唐綱嶺，張洪非，等.煙草中二硫代氨基甲酸酯農藥殘留量的測定［J］.煙草科技，2011（3）：47～50.

3 吳剛，王華雄，俞春燕，等.加速溶劑萃?。璆PC 液相色譜柱后衍生化測定動物源性食品中多種氨基甲酸酯類農藥殘留量［J］.中國食品衛生雜志，2008（5）：409～413.

4 劉長武，劉瀟威，翟廣書，等.固相萃?。咝б合嗌V法測定蔬菜、水果中的氨基甲酸酯殺蟲劑及其代謝物殘留［J］.色譜，2003，21（3）：255～257.

5 龔文杰，馬建明，鄔晨陽，等.高效液相色譜柱后衍生法測定環境水樣中氨基甲酸酯殘留化學測定方法［J］.中國衛生檢驗雜志，2005，15（7）：283～285.

6 Lehotay S J，Valverde－García A.Evaluation of different solidphase traps for automated collection and clean－up in the analysis of multiple pesticides in fruits and vegetables after supercritical fluid extraction［J］.J.Chromatogr A，1997，765（1）：69～84.

7 spectrometry，Lehotay S J，Eller K I，et al.Development of a method of analysis for 46pesticides in fruits and vegetables by supercritical fluid extraction and gas chromatography／ion trap mass［J］.JAOAC Int.，1995，78（3）：821～830.

8 陳笑梅，胡貝貞，劉海山，等.高效液相色譜－串聯質譜法測定糧谷中9種氨基甲酸酯類農藥殘留［J］.分析化學研究簡報，2007，35（1）：106～110.

9 趙穎，蔣施，金雁，等.食用菌中多種氨基甲酸酯類農藥殘留的超高效液相色譜－串聯質譜法測定研究［J］.化學通報，2012（2）：56～60.

10 中國預防醫學科學院營養與食品研究所.GB／T 5009.163——2003動物性食品中氨基甲酸酯類農藥多組分殘留高效液相色譜法測定［S］.北京：中華人民共和國衛生部，2004.

11 邵金良，黎其萬，劉宏程，等.高效液相色譜法測定蔬菜中8種氨基甲酸酯類農藥殘留［J］.現代食品科技，2011，10（7）：856～861.

12 朱銘立，張衛峰，聶建榮，等.高效液相色譜測定水產品中氨基甲酸酯類農藥多組分殘留［J］.廣東農業科學，2009（8）：244～245.

13 程盛華，唐斌，鄭龍，等.在線柱后衍生－熒光檢測－高效液相色法測定果蔬中殘留氨基甲酸酯農藥［J］.理化實驗室－化學分冊，2010，46（7）：816～819.

14 諸葛慶，李博斌，江濤，等.固相萃?。咝б合嗌V法測定黃酒中氨基甲酸乙酯［J］.釀酒科技，2012（1）：112～115.