HSV-1擴增子載體對神經系統疾病治療作用的研究進展

張 樺，史巧娣

單純皰疹病毒 1型（herpes simplex virus type-1，HSV-1）具有強神經親嗜性，已經被廣泛的用來構建各種基因轉移載體，常見的HSV-1源性基因載體包括條件復制性載體，復制缺陷型載體和HSV-1擴增子載體。HSV-1擴增子載體為不含病毒結構蛋白的假病毒載體，具有以下特點：①裝載容量大，可高達150 kb；②宿主細胞廣泛，既可感染分裂細胞又可感染非分裂細胞，包括中樞神經系統；③不含編碼病毒結構蛋白的基因等優勢。這些優勢使得HSV-1擴增子載體成為一種十分有力的神經系統疾病基因治療載體。本文將對HSV-1擴增子載體在神經系統疾病方面的應用作一綜述。

1 單純皰疹病毒概述

單純皰疹病毒1型屬于皰疹病毒家族，該家族包含多種不同的DNA病毒，常見的有以下幾種：單純皰疹病毒2型（herpes simplex virus type-2，HSV-2）， 水痘帶狀皰疹病毒（varicella zoster，HHV-3），人類巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV），卡波濟肉瘤相關病毒（Kaposi's sarcomaassociated herpesvirus，KSHV），EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）[1]。 其中，HSV-1，EVB[2]和 HCMV[3]由于其廣泛的細胞親嗜性和其生物學特性，已經被廣泛的用來構建各種基因轉移載體，其中，HSV-1相關性載體的發展更為引人注目。

2 HSV-1擴增子載體

HSV-1擴增子由以下元件組成：①包含有細菌復制起始點（如ColE1）的細菌質粒骨架載體；②HSV-1的順式作用元件復制起始點ori和切割包裝信號pac；③外源基因表達盒。在輔助病毒提供結構蛋白的情況下，HSV-1擴增子載體可包裝成假型病毒，該假型病毒含有與 HSV-1野生病毒相同的包膜結構，具有與 HSV-1相同的細胞感染親嗜性，其基因組DNA同樣可以以附加體的形式存在于宿主細胞核內。該載體不表達病毒基因組的結構基因，為完全的復制缺陷性載體，其可以以穩定地附加體形式存在于不分裂的細胞。作為一種基因治療載體，HSV-1擴增子載體的外源基因裝載量可高達150 kb，其外源基因既不僅可在分裂細胞中進行表達，也可在不分裂細胞中進行表達。此外，HSV-1擴增子載體不整合至宿主細胞，故其不會因外源基因的插入而導致宿主細胞的突變，從而具有很好的安全性。

3 HSV-1擴增子載體在神經系統疾病治療方面的應用

3.1 帕金森病 帕金森?。≒D）是一種神經退行性疾病，其發病機制與表達多巴胺神經遞質的中腦黑質神經元的選擇性丟失有關。多巴胺神經遞質的減少可導致機體出現運動障礙，包括靜止性震顫、運動遲緩、肌強直和姿勢步態異常等改變。目前，外源性給予左旋多巴是改善PD癥狀的最有效的方法。左旋多巴是合成多巴胺的前體，其在內源性多巴胺脫羧酶（aromatic amino acid decarboxylase，AADC）的作用下可轉化為多巴胺。然而，左旋多巴長時間應用會導致其失去藥效，因此，通過基因治療使受損細胞的功能得以重建顯得尤為重要。目前，已有通過病毒載體，包括HSV-1擴增子載體攜帶的基因治療分子應用于受損細胞的功能重建，其中包括攜帶與多巴胺合成有關的內源性功能酶 （如酪氨酸羥化酶Th和AADC）和對神經細胞具有保護作用的治療基因，包括膠質細胞源性神經生長因子 （glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF）和腦源性細胞生長因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF)，以保護剩余的多巴胺源性神經元。

近來，Sun及其同事在HSV-1擴增子載體具有高容量的基礎上，將與多巴胺生物合成和運輸有關的4種基因（Th，AADC，GTP水解酶I，囊狀單胺運載體I）在神經組織特異啟動子的啟動下克隆入HSV-1擴增子載體，隨后，通過無輔助病毒污染的包裝系統對該擴增子載體的包裝，并將其感染至由6-羥基多巴所致的PD動物模型，6個月后，由阿撲嗎啡誘導的PD動物的旋轉實驗得到很好的糾正，同時PD動物體內的多巴胺含量和K依賴的多巴胺的釋放量均有明顯增加。此外，Sun及其同事將不同的神經生長因子在神經特異啟動子的啟動下通過擴增子載體介導，即分別表達GDNF和BDNF的 HSV-1擴增子載體和同時表達GDNF和BDNF的HSV-1擴增子載體并通過無輔助病毒污染的載體包裝系統進行包裝，給予6-羥基多巴所致的PD動物，以比較不同神經生長因子對黑質多巴胺神經元的保護作用和相應受損癥狀的改善情況[4]。7個月后的實驗結果顯示，單獨給予GDNF較單獨給予BDNF和聯合給予GDNF和BDNF顯示出更好的神經保護作用和癥狀改善作用[4]。

3.2 缺血性腦損傷 腦卒中、腦供血不足等因素所導致的腦缺血性損傷，可使腦神經元、神經膠質細胞和其它類型細胞的氧和營養物質供應不足。缺氧可導致受損細胞發生一系列級聯反應，并最終導致細胞凋亡。HSV-1立即早期啟動子（如IE4/5基因啟動子）具有快速、高效的啟動基因表達的功能，因此，以HSV-1擴增子為載體，以HSV-1立即早期啟動子啟動抗凋亡因子或神經保護因子以期在最快的時間內表達相關基因，為缺血性腦卒中等所致的腦缺血性損傷的治療開辟了一條新的道路。Antonawich及其同事夾斷蒙古沙鼠雙側頸內動脈建立腦缺血模型，提前24 h將表達Bcl-2（一種抗凋亡分子）的HSV-1擴增子載體（HSVbcl-2)和空HSV-1擴增子載體分別提前給予左側和右側海馬，結果顯示，左側CA1海馬存活神經元較對側明顯增多[5]。Harvey等[6]對神經保護因子GDNF在缺血性腦卒中動物模型中的神經保護作用進行了相關研究。他們提前4 d將攜帶GDNF的HSV-1擴增子載體給予經夾閉單側大腦中動脈60 min所致的大鼠缺血性卒中模型的大腦皮層。結果顯示，GDNF在對缺血組織的神經保護方面和改善神經受損功能方面均較對照組顯示出良好的神經保護作用。相反，對夾閉單側大腦中動脈所致的大鼠缺血性卒中模型，3 d后給予HSV-1擴增子GDNF載體對缺血組織進行神經保護，結果顯示，缺血后給予GDNF未能對缺血組織顯示出神經保護功能，充分說明，GDNF對缺血神經元具有保護作用，且該保護作用不是由缺血后神經組織的自我修復所介導的。

此外，除了上述的神經保護基因GDNF之外，通過HSV-1擴增子載體攜帶的其它一些抗氧化基因如谷胱甘肽過氧化物酶基因（glutathione peroxidase gene，GPX）[7]，超氧化物歧化酶基因（superoxide dismutase，SOD-1)[8]，鈣結合蛋白D28K基因[9]，熱休克蛋白基因72（heat-shock protein gene，HSP72）和葡萄糖轉移酶基因（glucose transporter gene，GLUT）也已廣泛的應用于動物的缺血性卒中研究，并展示出了良好的神經保護作用。

3.3 遺傳性共濟失調 近來，有學者利用 HSV-1擴增子載體攜帶的治療基因對遺傳性共濟失調，包括毛細血管擴張性共濟失調癥（ataxia-telangiectasia，A-T）和弗里德賴希共濟失調癥（Friedrich's ataxia，FA)進行了相關研究。毛細血管擴張性共濟失調癥以神經退行性變，免疫缺陷和自發的腫瘤傾向為臨床上表現，有研究報道A-T突變相關基因（ATM）的突變與該疾病的發病機制密切相關[10]。FA共濟失調癥與frataxin蛋白的功能異常有關，研究顯示9號染色體長臂上的frataxin基因1號內含子區域內的GAA三核苷酸重復序列異常擴增可導致frataxin蛋白功能異常[11]。Frataxin蛋白功能缺失可引起腦脊髓的嚴重退行性變化，從而導致嚴重的運動系統共濟失調癥狀。Cortes及其同事將攜帶ATM基因長約9Kb的cDNA通過 HSV-1擴增子載體感染至A-T細胞系，以觀察相關細胞表型的改變[12]，同時，該研究小組將此擴增子載體感染至ATM基因缺陷的小鼠（Atm-/-）的小腦神經元，以進行進一步的研究[13]。此外，Cortes及其同事還通過HSV/AAV雜合擴增子載體介導將ATM基因的cDNA定點整合至Atm-/-小鼠的人AAS1位點[14]，然而，將ATM基因整合至Atm-/-小鼠以后，由于Atm-/-小鼠模型所表現的神經退行性方面不能反映出A-T患者的真實癥狀，使得小鼠并未表現出良好的基因校正功能。目前，基于 HSV-1擴增子載體對FA疾病的治療研究也有一定的報道。Gomez-Sebastian及其同事在BAC攜帶的 HSV-1擴增子載體的基礎上，將全長135 kb的完整的FRDA基因克隆入該擴增子載體，并將該載體感染至FA患者的原代成纖維細胞以觀察其基因校正功能。結果顯示：這些細胞在處于氧化應激時可表現出一定的基因恢復功能[15]。此外，Lim及其同事通過cre/loxp定點重組系統產生一種條件性的FD轉基因模型，通過將攜帶cre重組酶的HSV-1擴增子載體輸送至轉基因小鼠的腦干后cre重組酶對Loxp位點的定點打靶，可使小鼠產生典型的共濟失調癥狀，從而產生一種條件性的FA疾病模型。通過這種條件性的FA小鼠模型，Lim及其同事將攜帶Frataxin蛋白cDNA的HSV-1擴增子載體輸送至上述小鼠腦干部位，結果顯示，通過互補性的提供Frataxin至小鼠受損腦干，FA小鼠表現出良好的功能恢復行為?？傊?，基于HSV-1擴增子載體的這些研究為目前尚無有效治療方法的A-T和FA的可行性治療提供了一定的理論基礎。

3.4 阿爾茨海默病 阿爾茨海默病是一種進展性神經退行性病變，目前的研究表明，淀粉樣蛋白前體蛋白 （amyloidprecursor protein，APP)的異常剪切產物 β-淀粉樣多肽1-42（amyloid-β 1-42 amino acid peptide，Aβ1-42） 與該病的發生有密切關系[16]，該發現提示，基于HSV-1擴增子載體的免疫治療可應用于阿爾茨海默病的治療。因此，有學者將阻止Aβ產生過程和此后Aβ纏結過程的免疫治療策略應用于臨床前的AD動物模型，結果顯示相關策略可很好的阻止該疾病的進展[17]。最初的該方面的相關研究是一項基于輔助疫苗平臺的針對Aβ1-42的疫苗，將該疫苗應用于臨床前AD動物模型后取得了可喜的臨床前試驗結果。然而，在隨后應用AN-1792 Aβ輔助疫苗的二期臨床試驗中，部分患者出現了嚴重的炎癥反應[18]。這一結果使開發新的既可以打破患者對自身形成的Aβ的很好的耐受反應，又可以通過表達可以重塑患者體內免疫反應以降低Th2途徑介導的有害免疫反應的發生的新型疫苗平臺顯得更為重要。有學者將攜帶單獨Aβ1-42基因的 HSV-1擴增子載體（HSVAβ）或 Aβ1-42與破傷風毒素片段C融合基因的HSV-1擴增子載體（HSVAβ/TtxFC）給予Tg2576 AD小鼠，結果顯示，機體不僅加強了對Aβ的體液免疫反應，而且降低了Aβ在小鼠腦內的沉積[19]。然而，研究結果還顯示給予HSVAβ的小鼠海馬區域的炎癥因子 （如IFN-β，IFN-γ，IL-6和MIP-2） 轉錄水平的 mRNA量明顯增多，這說明腦內不同部位的免疫反應也存在一定的差異。白介素-4（Interleukin-4，IL-4)可引起Th2差異性免疫反應，最近有學者將表達Aβ和IL-4基因的無輔助病毒污染的 HSV-1擴增子（HSVIEAβCMVIL-4）輸送至轉基因AD小鼠（3xTg-AD)，該轉基因小鼠模型與人類阿爾茨海默病的發病機制相似[20]。分別在3xTg-AD小鼠2、3和9月齡時經皮下接種HSVIEAβCMVIL-4和相應的對照質粒，接種HSVIEAβCMVIL-4的小鼠由Th2介導的Aβ1-42的特異性IgG抗體含量明顯增加，這說明海馬區可很好的呈遞沉積的Aβ和磷酸化的Tau蛋白信號，同時，接種HSVIEAβCMVIL-4的小鼠在11月齡時進行迷宮學習和記憶評估的結果均較對照組提高，從而可以更好的說明降低AD的致病途徑可以改善AD的臨床癥狀。這些令人興奮的實驗結果為進一步的基于 HSV-1擴增子載體在阿爾茨海默病的治療中的應用打下基礎。

綜上所述可見，HSV-1擴增子載體由于其僅含有野生HSV-1基因組的復制起始點ori和包裝信號pac，不含編碼病毒的結構蛋白，具有很好的安全性，同時其還具有廣泛的細胞嗜性，巨大的裝載容量，較小的免疫源性和容易操作等優點，已成為一種十分有前景的基因治療載體，相信HSV-1擴增子載體在今后的日子里將進一步促進神經系統疾病基因治療的發展。

[1]Spaete RR,Frenkel N.The herpes simplex virus amplicon:a new eucaryotic defective-virus cloning amplifying vector[J].Cell,1982,30(3):295-304.

[2]White RE,Wade-Martins R,James MR.Infectious delivery of 120-kilobase genomic DNA by an Epstein-Barr virus amplicon vector[J].Mol Ther,2002,5(4):427-435.

[3]Mahmood K,Prichard MN,Duke GM,et al.Human cytomegalovirus plasmid based amplicon vector system for gene therapy[J].Genet Vaccines Ther,2005,3(1):1.

[4]Sun M,Kong L,Wang X,et al.Comparison of the capability of GDNF,BDNF,or both,to protect nigrostriatal neurons in a rat model of Parkinson's disease[J].Brain Res,2005,1052(2):119-129.

[5]Antonawich FJ,Federoff HJ,Davis JN.BCL-2 transduction,using a herpes simplex virus amplicon,protects hippocampal neurons from transient global ischemia[J].Exp Neurol,1999,156(2):130-137.

[6]Harvey BK,Chang CF,Chiang YH,et al.HSV amplicon delivery of glial cell line-derived neurotrophic factor is neuroprotective against ischemic injury[J].Exp Neurol,2003,183(1):47-55.

[7]Hoehn B,Yenari MA,Sapolsky RM,et al.Glutathione peroxidase overexpression inhibits cytochrome C release and proapoptotic mediators to protect neurons from experimental stroke[J].Stroke,2003,34(24):2489-2494.

[8]Davis AS,Zhao H,Sun GH,et al.Gene therapy using SOD1 protects striatalneurons from experimental stroke[J].Neurosci Lett,2007,411(1):32-36.

[9]Yenari MA,Minami M,Sun GH,et al.Calbindin d28k overexpression protects striatal neurons from transient focal cerebral ischemia[J].Stroke,2001,32(10):1028-1035.

[10]Lavin MF,Shiloh Y.The genetic defect in ataxia-telangiectasia[J].Annu Rev Immunol,1997,15(1):177-202.

[11]Campuzano V,Montermini L,Molto MD,et al.Friedreich's ataxia:autosomal recessive disease caused by an intronic GAA triplet repeat expansion[J].Science,1996,271(12):1423-1427.

[12]Cortes ML,Bakkenist CJ,Di Maria MV,et al.HSV-1 amplicon vector-mediated expression of ATM cDNA and correction of the ataxiatelangiectasia cellular phenotype[J].Gene Ther,2003,10(12):1321-1327.

[13]Cortes ML,Oehmig A,Perry KF,et al.Expression of human ATM cDNA in Atm-deficient mouse brain mediated by HSV-1 amplicon vector[J].Neuroscience,2006,141(12):1247-1256.

[14]Cortes ML,Oehmig A,Saydam O,et al.Targeted integration of functional human ATM cDNA into genome mediated by HSV/AAV hybrid amplicon vector[J].Mol Ther,2008,16(1):81-88.

[15]Lim F,Palomo GM,Mauritz C,et al.Functional recovery in a Friedreich's ataxia mouse model by frataxin gene transfer using an HSV-1 amplicon vector[J].Mol Ther,2007,15(10):1072-1078.

[16]Hardy J,Selkoe DJ.The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease:progress and problems on the road to therapeutics[J].Science,2002,297(3):353-356.

[17]Bowers WJ,Federoff HJ.Amyloid immunotherapy-engendered CNS inflammation[J].Neuro biol Aging,2002,23(7):675-676.

[18]Hock C,Konietzko U,Papassotiropoulos A,et al.Generation of antibodies specific for beta-amyloid by vaccination of patients with Alzheimer disease[J].Nat Med,2002,8(12):1270-1275.

[19]Bowers WJ,Mastrangelo MA,Stanley HA,et al.HSV amplicon mediated Abeta vaccination in Tg2576 mice:differential antigen-specific immune responses[J].Neurobiol Aging,2005,26(4):393-407.

[20]Frazer ME,Hughes JE,Mastrangelo MA,et al.Reduced pathology and improved behavioral performance in Alzheimer's disease mice vaccinated with HSV amplicons expressing amyloid-beta and interleukin-4[J].Mol Ther,2008,16(8):845-853.