混菌固態發酵生產菜籽肽工藝條件優化

鞠興榮，王雪峰，何 榮，王立峰，袁 建

(1.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省糧油品質控制及深加工技術重點實驗室，江蘇 南京 210003；2.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

混菌固態發酵生產菜籽肽工藝條件優化

鞠興榮1,2，王雪峰1，何 榮1,2，王立峰2，袁 建1

(1.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省糧油品質控制及深加工技術重點實驗室，江蘇 南京 210003；2.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

以肽得率、氮溶解指數和硫苷降解率為指標，通過單因素試驗初步得到枯草芽孢桿菌與雅致放射毛霉混菌固態發酵生產菜籽肽的發酵條件，再根據Box-Behnken中心組合試驗設計，在單因素試驗的基礎上，采用響應面分析法進一步優化混菌發酵條件，確定最佳工藝條件為：枯草芽孢桿菌與雅致放射毛霉同時接種，兩菌接種體積比4:1、發酵溫度32.1℃、發酵時間4.64d，此條件下菜籽肽得率為9.85%，硫苷降解率為67.83%。

混菌固態發酵；菜籽肽；工藝條件；響應面分析法

菜籽蛋白是一種豐富、優質的植物蛋白資源，但是卻沒有像大豆蛋白那樣得到廣泛的應用，主要原因有兩個：一是菜籽蛋白中含有少量硫苷、植酸、單寧等多種抗營養因子，降低了菜籽蛋白的生物利用率。其中，硫苷作為主要的抗營養因子，在酸、堿溶液中或者酶溶液中會發生分解，其分解產物能造成動物甲狀腺、肝臟、腎臟等器官的損害[1-3]，對動物的繁殖機能也會產生不同程度的影響；二是菜籽蛋白的研究力度還遠比不上大豆蛋白。近年來，國內外學者逐漸對菜籽蛋白進行了相關研究，如菜籽粕的脫毒[4]、菜籽蛋白的分離純化[5-6]、菜籽多肽的制備及其生物活性研究[7-8]等，這些技術的應用主要是為了解決菜籽蛋白本身營養價值高而利用率低的問題，為進一步開發、利用菜籽蛋白奠定了基礎。

近年來，發酵技術在大豆肽的生產中得到了廣泛應用，其中，混菌發酵技術的應用也逐漸得到了推廣[9-10]?；炀l酵生產菜籽肽的研究在我國鮮見報道，但混菌發酵脫毒菜籽粕的研究較多，且大量研究表明其脫毒效果明顯[11-12]。因此，如果將混菌發酵技術有效應用在菜籽肽的生產和菜籽粕的脫毒上，將為菜籽蛋白的高效利用提供一條新的途徑。本實驗在枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉混菌固態發酵生產菜籽肽培養基條件優化的基礎上，進一步探討接種順序、接種比例、發酵溫度以及發酵時間對混菌發酵效果的影響，應用單因素試驗和響應面分析法對混菌固態發酵的發酵條件進行優化，得到了混菌固態發酵生產菜籽肽的最佳發酵工藝條件，以期為菜籽肽的工業化生產提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菜籽粕(粗蛋白質含量38.47%、水分含量11.46%、硫苷含量52.38μmol/g) 南京隆盛植物油脂有限公司；Gly-Gly-Tyr-Arg 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 菌種與培養基

1.2.1 菌種

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)10160、雅致放射毛霉(Actinomucor elegans) 40252 中國工業微生物菌種保藏中心。

1.2.2 培養基

1.2.2.1 種子培養基

枯草芽孢桿菌采用營養瓊脂培養基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、蒸餾水1000mL、瓊脂20g，pH7.2，121℃滅菌20min，不加瓊脂作液體培養基使用；雅致放射毛霉采用PDA培養基：馬鈴薯300g、葡萄糖20g、瓊脂15g、蒸餾水1000mL。

1.2.2.2 發酵培養基

發酵培養基成分按混菌固態發酵生產菜籽肽培養基條件優化結果進行配比：菜籽粕9.5g、麩皮0.5g、加水1 3.5 g、葡萄糖添加量為固液總質量的0.5 0%、KH2PO4添加量為固液總質量的0.36%。

1.3 儀器與設備

立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司；722N紫外-可見分光光度計 上海精密科學儀器廠；GL-20B型高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；隔水式電熱恒溫培養箱 上海市躍進醫療器械一廠；全溫立式振蕩培養箱 太倉市實驗設備廠；PQX 型多段可編程培養箱 寧波東南儀器有限公司；ALpHA2-4型真空冷凍干燥機 德國Christ公司。

1.4 方法

1.4.1 菌懸液制備

枯草芽孢桿菌經斜面活化后刮取兩環接入100mL液體種子培養基，8層紗布封口后，在37℃、120r/min條件下搖瓶培養24h。雅致放射毛霉接種于斜面培養基上，于28℃恒溫培養5d。從枯草芽孢桿菌種子培養基和雅致放射毛霉斜面培養基中分別取一定量的細菌和孢子于無菌水中，調節菌體濃度為1×107CFU/mL。無菌水中事先加入葡萄糖和KH2PO4(分別以發酵培養基為基準，按添加量添加)，調節pH值至6.5，即可得到發酵劑。

1.4.2 發酵培養

混菌組合中的菌種不分先后，同時把制備好的菌懸液以1×107CFU/mL的接種量接入已滅菌的固態發酵培養基中，在一定的溫度和濕度條件下恒溫培養，定時攪拌通氣，培養一定時間后取樣測定。

1.4.3 發酵培養基的處理

發酵后的固態基質，一部分取樣后加蒸餾水定容至150mL，攪拌30min，2～4℃條件下4000×g離心20min，測定其上清液體積，用0.45μm微孔濾膜過濾上清液，除去不溶物和細菌，備用。另一部分取樣后冷凍干燥、粉碎，用于樣品中硫苷含量的測定。

1.4.4 肽含量標準曲線的制作

用5g/100mL三氯乙酸(TCA)配制不同質量濃度的Gly-Gly-Tyr-Arg標準溶液，按照多肽含量測定方法對樣品顯色，于波長540nm處測定其OD值。以多肽質量濃度為橫坐標(χ，mg/mL)，OD540nm值為縱坐標(y)，制作Gly-Gly-Tyr-Arg標準曲線，得到回歸方程y＝0.0259χ＋0.0034，R2＝0.9993。

1.4.5 指標測定

1.4.5.1 細菌數量測定

采用血球板計數法測定[13]。

1.4.5.2 氮溶解指數測定

參照文獻[14]所述方法進行測定。氮溶解指數按公式(1)計算。

1.4.5.3 多肽含量測定

參照文獻[15]所述方法，取5mL處理液，加入等體積10% TCA，靜置30min，2～4℃、4000×g離心20min，取2mL上清液，加8mL雙縮脲試劑，25℃靜置30min，測OD540nm值。肽得率按公式(2)計算。

1.4.5.4 硫苷含量測定

參照文獻[16]所述方法進行測定。硫苷降解率按公式(3)計算。

1.4.6 發酵條件優化試驗設計

在枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉混菌固態發酵生產菜籽肽培養基條件優化的基礎上，首先確定混菌發酵的接種順序，再分別對接種比例、發酵溫度和發酵時間3個因素進行單因素試驗，確定其最佳因素水平。根據單因素試驗結果，采用Box-Behnken中心組合試驗設計進行響應面法優化分析，得出菜籽肽混菌發酵的最佳發酵工藝條件。

2 結果與分析

2.1 混菌發酵接種順序的確定

枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉按體積比1:1的接種比例，采用同時接種、先接入枯草芽孢桿菌12h和24h后接入雅致放射毛霉、先接入雅致放射毛霉12h和24h后接入枯草芽孢桿菌的方法進行接種，30℃條件下發酵培養3d，考察不同接種順序對發酵指標的影響，結果見圖1。

圖1 不同接種時間對發酵指標的影響Fig.1 Effect of different inoculation patterns on fermentation indexes

由圖1可知，同時接種比分時間段接種的發酵效果要好，其中，除硫苷降解率變化不明顯外，肽得率和氮溶解指數的變化比較明顯，兩個指標均處于最大值，這可能是由于先接入的菌種在發酵過程中占有優勢地位，當再接入其他菌種時會產生競爭，影響了自身生長產酶[9]，因此確定接種順序為同時接種。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 混菌不同接種比例對發酵指標的影響

圖2 混菌不同接種體積比對發酵指標的影響Fig.2 Effect of inoculation ratio of Bacillus subtilis to Actinomucor elegans on fermentation indexes

將枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉按不同接種體積比(分別為1:2、1:1、2:1、3:1、4:1)同時接入到發酵培養基中，30℃條件下發酵培養3d，考察混菌不同接種體積比對發酵指標的影響，結果見圖2。3個指標都呈現先上升后下降的變化趨勢，其中，肽得率和氮溶解指數變化相對比較同步，都隨著枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉接種體積比的增加而增大，且在接種體積比為3:1時達到最大值，這表明：隨著接種比例的增加，兩種菌的生長具有互利性，能夠產生更多的蛋白酶水解菜籽蛋白并生成菜籽多肽。然而，硫苷降解率在接種體積比為2:1時達到峰值，之后隨著接種比例的增加而降低，說明接種比例的增加并不一直有利于這兩種菌產生更多的芥子酶系，但相對肽得率和氮溶解指數，硫苷降解率在接種體積比為1:1～3:1之間變化并不明顯。綜合考慮枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉混菌發酵較佳的接種體積比為3:1。

2.2.2 不同發酵溫度對發酵指標的影響

枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉按接種體積比3:1，同時接入到發酵培養基中，分別在20、25、30、35、40℃條件下發酵培養3d，考察不同發酵溫度對發酵指標的影響，結果見圖3。

圖3 不同發酵溫度對發酵指標的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on fermentation indexes

溫度的變化對枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉兩種菌的生長、產酶及酶的活性有著直接的影響。由圖3可知，溫度過低或過高均不利于這兩種菌的混合發酵，溫度過低，菌體生長不佳，產酶量較少；溫度過高，會抑制其生長，甚至導致其死亡。隨著發酵溫度的增高，3個指標均呈現先上升后下降的趨勢，在30～33℃之間發酵效果較好，并在30℃各項發酵指標都達到最大值。因此，選取30℃作為混菌發酵的最佳溫度。

2.2.3 不同發酵時間對發酵指標的影響

枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉按接種體積比3:1，同時接入到發酵培養基中，在30℃條件下分別發酵培養2、3、4、5、6d，考察不同發酵時間對發酵指標的影響，結果見圖4。

圖4 不同發酵時間對發酵指標的影響Fig.4 Effect of fermentation duration on fermentation indexes

發酵時間會對菜籽粕中菜籽蛋白的水解程度、菜籽肽的生成量以及硫苷的降解效果產生一定的影響。發酵時間過短，菌體不能得到充分生長，產酶不足，菜籽蛋白的水解程度較低，多肽生成量少，硫苷的降解效果也較差；發酵周期過長，菌體會消耗過多營養物質或出現衰亡，導致菜籽蛋白水解程度降低，多肽生成量減少，生產成本增加。由圖4可知，發酵時間對發酵指標具有顯著性影響。隨著發酵時間的延長，肽得率逐漸增加，在4～5d達到最大值并趨于穩定；氮溶解指數呈現先上升后下降的變化趨勢，在3～4d達到較高值，隨后出現較大幅度的下降，其原因可能是微生物生長利用了其中的無機氮；硫苷降解率在發酵第3天后趨于穩定，表明發酵時間的延長并沒有對硫苷的降解效果產生多大的影響。研究還發現，在發酵5～6d期間，發酵基質的顏色逐漸加深，并出現較為濃烈的氨味。因此，確定混菌發酵的較佳時間為4d。

2.3 響應面分析法優化混菌發酵條件

2.3.1 響應面分析法分析試驗結果

根據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，綜合單因素試驗結果，選取混菌接種體積比、發酵溫度和發酵時間對枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉混菌發酵影響較大的這3個因素，以發酵產物的菜籽肽得率為響應值，設計了三因素三水平的響應面分析試驗。各因素及水平編碼如表1所示。

表1 Box-Behnken中心組合試驗設計因素水平及編碼Table 1 Coded levels of the variables tested in Box-Behnken design

為了最優擬合二次多項回歸方程各項系數，依據統計學試驗設計要求，對影響菜籽肽得率的混菌發酵關鍵內在因素進行了15組試驗，其中1～12為析因試驗，13～15為中心試驗，用以估計試驗誤差，試驗設計及結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計及發酵產物的菜籽肽得率測定結果Table 2 Box-Behnken design and measured and predicted values of rapeseed peptide yield

2.3.2 模型的建立與顯著性檢驗

利用Design Expert軟件對表2中的試驗數據進行多元回歸擬合，選擇對響應值顯著的各項，可得混菌接種體積比、發酵溫度及發酵時間與菜籽肽得率間的二次多項回歸方程：

對回歸方程進行方差分析和顯著性檢驗，結果見表3、4。

表3 菜籽肽得率二次多項式擬合模型方差分析結果Table 3 ANOVA results for the fitted quadratic polynomial model for rapeseed peptide yield

由表3回歸方程方差分析可知，二次多項式擬合模型具有高度的顯著性(P＝0.0002＜0.01)，P值越小，其因素影響越顯著；失擬項在α＝0.05水平上不顯著(P＝0.3729＞0.05)，說明該模型的擬合檢驗顯著；Y的變異系數較低(2.39%)，說明實驗操作具有一定的可信度；模型校正決定系數為0.9736，差異顯著，表明該模型擬合優度好，預測值與實測值之間具有高度相關性(相關系數R2＝0.9906)，發酵產物的菜籽肽得率僅有2.64%的總變異度不能由該模型解釋，所以此模型可應用于菜籽肽發酵實驗的理論預測。

表4 菜籽肽得率回歸方程系數顯著性檢驗結果Table 4 Significance test of regression coefficients for rapeseed peptide yield

對二次多項回歸方程的回歸系數顯著性檢驗表明(表4)，在α＝0.01水平上，因素X2、X3對菜籽肽得率的線性效應高度顯著，因素X22、X32對菜籽肽得率的曲面效應高度顯著，說明發酵溫度、發酵時間皆對菜籽肽得率的影響高度顯著；在α＝0.05水平上，因素X1對菜籽肽得率的線性效應顯著，因素X2X3的交互作用顯著，說明發酵溫度與發酵時間之間的交互作用對菜籽肽得率有顯著性影響，而混菌接種體積比對菜籽肽得率的線性影響顯著。通過顯著性檢驗可以看出，各因素對菜籽肽得率的影響不是簡單的線性關系，在本實驗范圍內，混菌發酵過程中各因素對菜籽肽得率的影響大小依次為發酵溫度、發酵時間和混菌接種體積比。

2.3.3 菜籽肽得率的響應面分析與優化

通過二次多項回歸方程所作響應曲面圖及其等高線圖，可以直觀地反映出發酵條件對菜籽肽得率的影響。等高線圖還可揭示出各因素之間交互作用的顯著性。當固定枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉接種體積比為4:1時，發酵溫度與發酵時間對菜籽肽得率影響交互作用的等高線圖和響應曲面圖如圖5所示。此兩因素之間的交互作用顯著，這是因為等高線的形狀能夠反映出兩因素之間交互效應的強弱大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，橢圓形則表示兩因素交互作用顯著[17]。另外，在本實驗水平范圍內，隨著發酵時間的延長，肽得率先增大后減??；隨著發酵溫度的增大，肽得率逐漸增大，并且在發酵溫度為32℃附近達到理論最大點。當發酵時間在4.3～5.0d，發酵溫度在31～33℃時，菜籽肽得率可達9.80%以上。

圖5 發酵溫度和發酵時間交互影響菜籽肽得率的曲面圖及其等高線圖Fig.5 Response surface plot and contour plot of rapeseed peptide yieldversus fermentation temperature and fermentation time

為了進一步求得各因素的最佳條件組合，對回歸方程求一階偏導數，當響應值Y有最大值時可求得各因素的水平：X1＝1.00、X2＝0.64、X3＝0.41，轉換后得到最佳發酵條件為：混菌接種體積比4:1、發酵溫度32.1℃、發酵時間4.64d(111h)，在此條件下預測混菌發酵后，發酵產物的菜籽肽得率模型預測值可達到9.93%。

2.3.4 模型驗證性實驗

為了檢驗模型預測的有效性，根據Box-Behnken中心組合試驗和二次多項回歸方程分析結果，在菜籽肽得率最高時的發酵條件下，進行發酵重復實驗，此條件下實際所得菜籽肽得率為9.85%，這與模型預測值(9.93%)僅相差0.81%，十分接近，可見該模型能夠較好地預測實際的發酵情況，由此表明響應面分析法應用于發酵條件的優化是可行有效的。該優化條件下所得發酵產物的菜籽肽得率在培養基條件優化的基礎上相對提高了43.8%，比優化前[18]相對提高了98.6%，發酵條件優化效果較好。另外，在該優化條件下測得實際的硫苷降解率為67.83%，也要高于培養基條件優化后的62.09%和優化前的60.87%，說明發酵條件優化后，菜籽粕中的硫苷降解效果比優化前得到一定程度的改善。

3 結 論

本實驗以肽得率、氮溶解指數和硫苷降解率為評價指標，研究了枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉混菌固態發酵生產菜籽肽的發酵條件，并以發酵產物的菜籽肽得率為響應值，應用響應面分析法優化了菜籽肽的發酵工藝。通過單因素試驗，確定接種比例、發酵溫度和發酵時間對菜籽肽得率有顯著影響，在此基礎上，根據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，采用三因素三水平的響應面分析試驗，對試驗結果進行分析比較，確定了最佳發酵條件。

綜合枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉混菌固態發酵生產菜籽肽培養基條件優化結果和發酵條件優化結果，最終得到最佳發酵工藝條件為：以菜籽粕和麩皮為基質，菜籽粕添加量為95%，麩皮為5%，基質與加水量質量比為1:1.35，葡萄糖與KH2PO4的添加量分別為固液總質量的0.50%和0.36%，在以上優化培養基條件下調節、初始pH6.5、枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉同時接種、接種體積4:1、發酵溫度32.1℃、發酵時間4.64d (111h)。在此工藝條件下，發酵產物的菜籽肽得率實際可達9.85%，比優化前相對提高了98.6%，發酵效果較為明顯。同時測得該工藝條件下發酵產物的硫苷降解率為67.83%，也要高于優化前的60.87%，這表明優化后菜籽粕中的硫苷降解效果比優化前得到一定程度的改善。

通過優化枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉混菌固態發酵生產菜籽肽的工藝條件得到較佳的發酵工藝條件參數，在該條件下經發酵所得的發酵產品不僅具有較高含量的菜籽蛋白肽，而且其硫苷含量要遠低于飼用菜籽粕的國家標準，可以作為飼料添加劑應用于飼料工業中，這為菜籽蛋白資源的利用提供了參考。

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Optimization of Rapeseed Peptide Production by Mixed Solid-State Fermentation

JU Xing-rong1,2，WANG Xue-feng1，HE Rong1,2，WANG Li-feng2，YUAN Jian1
(1. Key Laboratory of Grain and Oils Quality Control and Deep-Utilizing Technology of Jiangsu Province, College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210003, China；2. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Based on peptide yield, nitrogen solubility index (NSI) and glucosinolate degradation rate, the production conditions for rapeseed peptide by mixed solid-state fermentation using Bacillus subtilis and Actinomucor elegans preliminarily determined by one-factor-at-a-a-time method and further optimized by response surface analysis coupled with Box-Behnken design. The optimal fermentation conditons were 4:1 of Bacillus subtilis-to-Actinomucor elegans ratio, 32.1 ℃ of fermentation temperature, 4.64 d of fermentation time, resulting in a peptide yield of 9.85% and a glucosinolate degradation rate of 67.83%.

mixed solid-state fermentation；rapeseed peptide；process conditions；response surface methodology

TQ936.16

A

1002-6630(2012)11-0231-06

2011-12-17

國家農業成果轉化資金項目(2009C10045)；江蘇省農業科技自主創新基金項目(cx(10)444；cx(10)234)；江蘇省自然科學基金項目(BK2010573)

鞠興榮(1957—)，男，教授，博士，主要從事食品營養及功能性成分研究與開發。E-mail：xingrongju@163.com