Agkihpin對人肝癌SMMC-7721細胞COX-2、MRP1和E-CD表達的影響

胡啟平，許淑茹，黃程新，馬 軍，方 玲，袁志剛

(1廣西醫科大學細胞生物學與遺傳學教研室，南寧 530021;2漳州衛生職業學院)

近年來，蛇毒的抗腫瘤作用重新引起了國內外學者的關注［1～3］。精氨酸酯酶(Arginine Esterase，AEase)廣泛存在于蝰科蛇類的蛇毒中蛇毒精氨酸酯酶(Agkihpin)是我們前期研究中從蝮蛇毒中自行分離純化并命名的一種AEase，其為電泳純，約25.46 kD［4］，可下調抑制人鼻咽癌 CNE-2 細胞系中環氧合酶-2(Cyclooxygenase，COX-2)、表皮鈣黏素(Epidermal cadherin，E-CD)和多藥耐藥相關蛋白1(Multidrug resistance associated proteins 1，MRP1)的轉錄和表達［5～7］，并抑制鼻咽癌細胞的活力、增殖和遷移［8］。以往有研究發現，從蝮蛇毒中分離出來的AEase活性峰(非電泳純)對人肝癌細胞株的殺傷能力比蝮蛇粗毒高5倍［9］;我們的前期研究亦發現Agkihpin可抑制人肝癌SMMC-7721細胞株的活力、增殖和遷移。近年研究發現，COX-2、E-CD和MRP1在正常肝組織和肝細胞癌(HCC)組織中轉錄和表達差異較大，與HCC癌組織分化程度、腫瘤分級和轉移關系密切。2011年3～12月，我們觀察了Agkihpin對人肝癌 SMMC-7721細胞中 COX-2、MRP1和E-CD表達的影響，旨在進一步探討Agkihpin影響人肝癌SMMC-7721細胞活力、增殖和遷移的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細胞株SMMC-7721(中南大學提供);Agkihpin( 自 行 分 離 純 化)［4］，RPMI1640(GIBCO)，0.25% 胰酶(索萊寶公司)，新生牛血清(杭州四季青公司)，兔抗人COX-2、MRP1和E-CD抗體(北京博奧森公司)、羊抗兔HRP抗體(北京中山公司);免疫組化試劑盒(福州邁新生物公司)，RNA提取試劑盒(天根公司)，MTT(Sigma公司)，逆轉錄試劑盒(Fermentas公司)等;倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，PCR擴增儀為(ABI公司)，凝膠成像系統(DIO-RAD公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 取人肝癌細胞株 SMMC-7721，用含10%新生牛血清的RPMI1640培養基(添加100 IU/mL青霉素和鏈霉素)，于37℃、5%CO2培養箱中培養，2～3 d換液一次，選用對數生長期的細胞用于下述實驗。

1.2.2 細胞干預及 COX-2、E-CD、MRP1 蛋白表達檢測 ①免疫細胞化學法:取對數生長期SMMC-7721細胞，以1×105個/mL接種于預置蓋玻片的6孔板中，每孔加2 mL的培養基，在37℃、5%CO2培養箱培養24 h，細胞貼壁后分為8組，換置新培養液，分別加入終質量濃度為 4.130、2.065、1.033、0.516、0.413、0.259、0.207 及0.000 g/mL 的 Agkihpin的培養基，培養72 h后PBS洗滌3次，Elivison二步法進行細胞染色:PBS配置的0.5%Triton X-100室溫孵育10 min，一抗4℃孵育過夜，PBS洗滌3次，廣譜二抗室溫孵育30 min，PBS洗滌3次，DAB顯色，以PBS代替一抗為空白對照。實驗重復3次。染色結果用Image-Pro Plus6.0軟件分析，蛋白表達強度用平均吸光密度(Average optical density，AOD)表示;按公式計算下調率(Down-regulated rate，DRR):DRR=(AOD對照組－AOD實驗組)/AOD對照組×100%。②Western blotting法:取對數生長期SMMC-7721細胞，以1×105/mL接種于100 mL培養瓶，37℃、5%CO2培養箱培養24 h。細胞貼壁后分為8組，同上加入含Agkihpin的培養基培養72 h，用RAPI裂解液提取蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白含量。以每樣品總量20 μg蛋白于8%SDSPAGE凝膠電泳，采用半干式轉印法將蛋白轉印到PVDF膜上，0.5 mA恒流電轉移30 min;濾膜經5%脫脂奶粉于室溫下封閉1 h;加一抗4℃孵育過夜;洗膜，辣根過氧化物酶標記的二抗與PVDF膜于室溫下孵育2 h;充分漂洗，ECL顯色試劑盒顯色，對顯色條帶進行光密度分析，以目的基因與內參基因βactin的光密度比值(Ratio of AOD，RAOD)作為COX-2、E-CD及MRP1蛋白的相對表達量;同上計算DRR。

1.2.3 細胞干預及 COX-2、E-CD、MRP1 mRNA 轉錄檢測 細胞培養及干預方法同1.2.2。檢測步驟:①引物:根據GenBank數據庫提供的mRNA序列信息，采用 Primer Premier5.0軟件設計引物，經BLAST比對后由上海生工生物工程有限公司合成。COX-2:5'-TCCTCCTGTGCCTGATGATTG-3'，5'-AAACTGATGCGTGAAGTGCTG-3'，172 bp;MRP1:5'-TC TACTTCTTCGTCCAGAGGTTCT-3'，5'-CTCAGTCTCTGAATACTCCTTGAGC-3'，440 bp;E-CD:5'-CTGAT TCTGCTGCTCTTGCTGTT-3'，5'-TCAAAGTCCTGGTCCTCTTCTCC-3'，137 bp; β-actin:5'-AACTCCATCATGAAGTGTGA-3'，5'-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3'，247 bp。②RNA提取和 cDNA合成:按 RNA提取試劑盒說明書提取肝癌細胞總RNA，經瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，通過紫外分光光度計測定260、280 nm處光密度值，計算RNA純度與濃度。根據MBI公司RT試劑盒操作說明將RNA逆轉錄為cDNA，保存于－70℃冰箱備用。③基因轉錄水平檢測:采用RT-PCR法。反應體系25 μL:其中10× buffer 2.5 μL，25 mM/L MgCl22 μL，10 mM/μL dNTP 2 μL，10 pmol/μL 上、下游引物各 1 μL，cDNA模板2 μL，Taq 聚合酶 0.3 μL，再用 ddH2O 補足至25 μL。PCR循環參數:95℃預變性5 min，94℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，擴增35 個循環，72 ℃后延伸5 min。取RT-PCR 產物5 μL，在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳，溴化乙錠顯色，置自動凝膠成像分析系統中照相，分別取目的基因與內參基因β-actin RT-PCR產物電泳條帶灰度比值(Ratio of gray value of electrophoresis strip，RGVES)，作為目的基因mRNA的相對含量。DRR計算同上。

1.3 統計學方法 應用SPSS13.0軟件進行統計學處理。計量數據采用±s表示。計量資料多組比較經方差齊性檢驗，方差齊者采用方差分析(Oneway ANOVA)，兩兩比較采用LSD法。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 COX-2蛋白表達 ①AOD:COX-2陽性染色顆粒主要位于SMMC-7721細胞質中，呈棕黃色或淺黃色，以PBS代替一抗的陰性對照染色結果顯示無陽性表達(圖1);COX-2蛋白的AOD隨Agkihpin質量濃度上升而下降(R2=0.909 3)，呈一定程度濃度依賴性;與質量濃度為0者比較其余質量濃度組表達均顯著下降(P＜0.01)，見圖 1和表 1。②RAOD:COX-2蛋白的RAOD隨Agkihpin質量濃度上升而下降(R2=0.961 4)，呈一定程度濃度依賴性，且與質量濃度為0者比較其余質量濃度組表達均顯著下降(P＜0.01)，見表1和圖2A。

圖1 免疫細胞化學法檢測SMMC-7721細胞中COX-2蛋白表達(×400)

2.2 COX-2 mRNA轉錄 COX-2的 RGVES值隨Agkihpin質量濃度上升而下降(R2=0.984)，呈一定程度濃度依賴性，且與質量濃度為0者比較其余質量濃度組表達均顯著下降(P＜0.01)，見表1和圖2B。

表1 不同質量濃度Agkihpin作用72 h后SMMC-7721細胞 COX-2 表達(±s)

表1 不同質量濃度Agkihpin作用72 h后SMMC-7721細胞 COX-2 表達(±s)

注:與質量濃度為0者比較，*P＜0.01;與上一質量濃度比較，△P＜0.05，#P ＜0.01

Agkihpin質量濃度(μg/mL)AOD RAOD RGVES 0.000 0.040 8 ±0.003 9 0.848 1 ±0.043 2 0.267 1 ±0.019 5 0.207 0.029 9 ±0.003 0* 0.725 5 ±0.015 3＊△0.158 7 ±0.015 4*#0.259 0.028 4 ±0.002 6*#0.638 9 ±0.040 4* 0.157 6 ±0.016 5＊△0.413 0.024 1 ±0.003 0* 0.628 5 ±0.064 9* 0.162 0 ±0.017 1*0.516 0.021 9 ±0.003 3*#0.580 7 ±0.041 0* 0.116 1 ±0.027 7*1.033 0.016 1 ±0.003 5* 0.530 5 ±0.008 9*#0.094 6 ±0.008 9*#2.065 0.017 3 ±0.003 5＊△0.394 2 ±0.053 9*#0.084 0 ±0.029 3＊△4.130 0.014 2 ±0.001 7* 0.337 3 ±0.021 0* 0.027 9 ±0.001 2*

圖2 不同質量濃度Agkihpin處理后SMMC-7721細胞COX-2 mRNA表達

2.3 COX-2、MRP1、E-CD 之間的蛋白表達和 mRNA轉錄的關系 Agkihpin作用72 h后，SMMC-7721細胞中COX-2與E-CD的蛋白表達和mRNA轉錄呈負相關，MRP1與E-CD的蛋白表達和mRNA轉錄呈負相關，COX-2與MRP1的蛋白表達和mRNA轉錄呈正相關(細胞免疫化學法、Western Blotting和RT-PCR法檢測結果的相關系數r分別為0.960 1、0.947 4 和 0.943 9)。見圖 3A、3B(MRP1和E-CD蛋白表達和mRNA轉錄的具體數據另文詳細發表)。

圖3 不同濃度Agkihpin作用72 h后SMMC-7721細胞COX-2、MRP1、E-CD的蛋白和mRNA表達

3 討論

多項研究顯示，Agkihpin可影響人肝癌SMMC-7721細胞活力、增殖和遷移，但具體機制不明。COX-2是人體內花生四烯酸代謝過程中的限速酶，一般在受促癌劑或癌基因產物等因素刺激時迅速合成，因此COX-2在HCC癌組織中的表達均顯著高于癌旁組織和正常肝組織［10～11］。其作用機制包括促進腫瘤細胞增殖，抑制凋亡;增加金屬蛋白酶-2的活性，溶解胞外基質，促進腫瘤的浸潤等。本研究免疫細胞化學、Western blotting和RT-PCR檢測顯示，COX-2的 AOD、RAOD及RGVES均隨Agkihpin質量濃度上升而下降，呈一定程度濃度依賴性，且與質量濃度為0者比較其余質量濃度組表達均顯著下降。提示Agkihpin可在體外條件下顯著下調細胞中COX-2的蛋白表達和基因轉錄水平，且呈一定濃度依賴性。此可能為其抑制SMMC-7721細胞增殖和遷移的機制之一。研究顯示，癌組織中COX-2表達高者術后生存率低，且無瘤生存期也較短［12］。故Agkihpin可考慮作為提高肝癌患者術后生存率、抑制肝腫瘤形成的藥物。本研究還顯示，免疫細胞化學法和Western blotting檢測的COX-2蛋白表達水平DRR不一致，前者稍高?？赡茉驗槊庖呒毎瘜W法檢測時顯微鏡下目標視野的選定主觀性較強，而Western blotting檢測的是培養細胞整體的蛋白表達水平，因此后者結果更可信［6］。鑒于Agkihpin可下調COX-2 mRNA轉錄，說明Agkihpin可通過某一信號通路將其COX-2表達調節作用轉導進入SMMC-7721細胞。此外，本研究中免疫細胞化學法及Western blotting所測COX-2的DRR均明顯低于RT-PCR所測結果。推測Agkihpin還參與了COX-2的翻譯調節，可使COX-2的翻譯上調。本研究中圖3還顯示，Agkihpin作用后各組 MRP1蛋白表達和基因轉錄水平均比較相近，而COX-2和ECD的蛋白表達水平均比基因轉錄水平高出許多。提示Agkihpin亦參與了E-CD的翻譯調節。

Oshima等認為COX-2基因可能與腺瘤性息肉病(Adenomatous polyposis coli，APC)基因相關聯，而APC基因產物又與E-CD的配體β-連環素相關聯，提示Agkihpin也可能通過APC調控COX-2和E-CD表達。有研究表明，部分AEase具有磷酯酶A2(Phospholipase A2，PLA2)特性［13］，而在人的多種組織細胞中均可檢測到PLA2 M型受體［14］，蛇毒中部分PLA2可與PLA2 M型受體結合產生細胞因子、趨化因子和激素而起抗腫瘤作用［15］。Agkihpin有可能作為一種PLA2與SMMC-7721細胞膜上的PLA2 M型受體結合，通過PLA2信號轉導途徑調節COX-2的轉錄和翻譯水平。此外，Agkihpin具有胰蛋白酶活性，能消化細胞基質和細胞表面蛋白［8］，對于MRP1和E-CD等表達在細胞膜上和(或)細胞內的蛋白［6，7］，其轉錄和表達的調節可能是胰蛋白酶活性和PLA2信號轉導途徑綜合作用的結果;而對于COX-2等僅在細胞質中表達的蛋白，其表達調節可能以PLA2信號轉導途徑為主。具體機制尚待深入研究。Lu等［16］認為，COX-2表達上調可引起前列腺素合成增加，誘導PKC表達，進而誘導MRP1表達，Agkihpin可能間接通過下調COX-2表達下調MRP1的轉錄和表達。本研究顯示，Agkihpin作用72 h后，SMMC-7721細胞中COX-2與E-CD蛋白表達呈負相關，MRP1與E-CD的蛋白和mRNA表達呈負相關，COX-2與MRP1的蛋白和mRNA表達呈正相關，與上述文獻一致。

MRP1過度表達是產生腫瘤耐藥的主要原因［17］，細胞耐藥程度與MRP1表達強度呈明顯正相關［18］。本研究顯示，Agkihpin 作用后 SMMC-7721細胞 MRP1表達量下調。提示Agkihpin可降低SMMC-7721細胞對細胞毒性物質的排除能力，使細胞損傷加劇。此可能是Agkihpin能降低SMMC-7721細胞活力的原因之一。MRP反義RNA可有效封閉MRP基因表達，在體外實驗中能增加人肝癌SMMC-7721耐藥細胞株對化療藥物的敏感性，對肝癌耐藥細胞的多藥耐藥表型有較好的逆轉作用［19］。故Agkihpin可通過下調SMMC-7721細胞的MRP1表達，在一定程度上提高肝癌細胞對化療藥物的敏感性、逆轉肝癌耐藥細胞的多藥耐藥表型。E-CD在正常肝組織中表達，在肝癌組織中表達程度減弱或缺失［20］，高轉移潛能肝癌細胞E-CD表達較低轉移肝癌細胞明顯降低［21］，癌組織中E-CD黏附系統受到干擾、破壞可觸發癌細胞的浸潤和轉移［22］。提示E-CD表達下調或缺失是促進腫瘤細胞浸潤和轉移的重要因素［23～24］。本研究顯示，Agkihpin 作用后SMMC-7721細胞中E-CD基因轉錄和蛋白表達水平均顯著上調，且呈一定程度的劑量依賴性。提示Agkihpin可能通過上調細胞表面E-CD表達，進一步使其與α-/β-/γ-連環蛋白形成復合物，加強E-CD介導的細胞—細胞間、細胞—介質間的黏附，避免細胞與介質間脫離。此可能是Agkihpin抑制肝癌SMMC-7721細胞遷移的主要原因。

綜上所述，Agkihpin可通過下調 MRP、COX-2表達及上調E-CD表達抑制人肝癌SMMC-7721細胞的的活力、增殖和遷移，有望用于提高肝癌細胞對化療藥物的敏感性、逆轉肝癌耐藥細胞的多藥耐藥表型、提高肝癌患者術后生存率、抑制肝癌細胞的浸潤和轉移。

［1］Jokhio R，Ansari AF.Cobra snake venom reduces significantly tissue nucleic acid levels in human breast cancer［J］.Journal Pakistan Medical Association，2005，(55):71-73

［2］Stephen S，Fritz C，Radu M，et al.Intravenous liposomal delivery of the snake venom disintegrin contortrostatin limits breast cancer progression［J］.Pak J Physiol，2006，2(1):499-511.

［3］李振南，張小燕，芮景.蛇毒抗高凝狀態酶對種植肝癌H22小鼠腫瘤抑制作用的研究［J］.實用臨床醫藥雜志，2007，11(3):45-48

［4］胡啟平，舒雨雁.江浙蝮蛇毒精氨酸酯酶Agkihpin的研究:Ⅰ、分離純化和初步表征［J］.四川動物，2006，25(2):251-256.

［5］胡啟平，許淑茹，馬軍，等.蛇毒精氨酸酯酶Agkihpin對人鼻咽癌CNE-2細胞系環氧合酶-2表達的影響研究［J］.中國全科醫學，2011，14(24):2761-2764.

［6］許淑茹，馬軍，袁志剛，等.蛇毒精氨酸酯酶Agkihpin對人鼻咽癌CNE-2細胞系MRP1表達的影響［J］.腫瘤防治研究，2011，38(7):731-735.

［7］許淑茹，馬軍，袁志剛，等.蛇毒精氨酸酯酶Agkihpin對人鼻咽癌CNE-2細胞系E-鈣粘素表達的影響［J］.中華全科醫學，2011，9(4):503-504，507.

［8］胡啟平，舒雨雁.江浙蝮蛇毒精氨酸酯酶Agkihpin的研究:Ⅱ.對鼻咽癌細胞活力、增殖、遷移和細胞形態的影響［J］.四川動物，2006，25(2):257-260.

［9］陳清澄，劉廣芬，王晴川.蝮蛇蛇毒柱層析分離及生化藥理作用［J］.福建醫學院學報，1994，28(2):134-136.

［10］陳連周，夏金堂，李雯，等.肝細胞肝癌中環氧合酶-2與半胱氨酸蛋白酶-3的表達及意義［J］.中華臨床醫師雜志(電子版)，2008，2(10):1128-1134.

［11］Koga H，Sakisaka S，Ohishi M，et al.Expression of cyclooxygenase-2 in human hepatocellular carcinoma:relevanee to tumor dedifferentiation［J］.Hepatology，1999，29(3):688-696.

［12］Kondo M，Yamammoto H，Nagamo H，et al.Increased expression of COX-2 in non tumor liver tissue is associated with hepatoceluller carcinoma［J］.Clin Cancer Res，1999，5(12):4005-4012.

［13］Zhang QY，Wang JY，Han Y，et al.Identification of a novel thrombin-like phospholipase A2 from Gloydius ussuriensis snake venom［J］.Blood Coagul Fibrinolysis，2007，18(8):723-729.

［14］Boskovic J，Arnold JN，Stilion R，et al.Structural model for the mannose receptor family uncovered by electron microscopy of Endo180 and the mannose receptor［J］.J Biol Chem，2006，281(13):8780-8787.

［15］Zuliani JP，Fernandes CM，Zamuner SR，et al.Inflammatory events induced by Lys-49 and Asp-49 phospholipases A2 isolated from Bothrops asper snake venom:role of catalytic activity［J］.Toxicon，2005，45(3):335-346.

［16］Lu JK，Wang YQ，Sun YH，et al.Correlation between COX-2 and MRP in NSCLC［J］.Chin J Pathophysiol，2008，24(3):605-606，616.

［17］Funato T，Harigae H，Abe S，et al.Assessment of drug resistance in acute myeloid leukemia［J］.Expert Rev Mlo Diagn，2004，4(5):705-713.

［18］Konig J，Hartel M，Nies AT，et al.Expression and localization of human multidrug resistance protein(ABCC)family members in pancreatic carcinoma［J］.Int J Cancer，2005，15(3):359-367.

［19］陳琳，茍興華，嚴律南，等.重組腺病毒介導MRP反義RNA對人肝癌耐藥細胞株MDR表型逆轉的實驗研究［J］.實用腫瘤雜志，2005，20(6):484-489.

［20］閆田靜，易永芬，鄧瑋，等.高爾基體α-甘露糖苷酶Ⅱ和E-鈣黏素在正常肝組織及肝癌組織中的表達及其意義［J］.中國生物制品學雜志，2011，24(5):534-537，546.

［21］張傳海，許戈良，莢衛東，等.缺氧誘導因子-1α與上皮型鈣黏素在肝癌中的表達及其意義［J］.安徽醫科大學學報，2011，46(4):337-341.

［22］Becker KF，Kremmer E，Eulitz M，et al.Functional allelic loss detected at the protein level in archival human tumours using allelespecific E-cadherin monoclonal antibodies［J］.Pathol，2002，197(5):567-574.

［23］Fukunaga Y，Liu HJ，Shimizu M，et al.Defining the Roles of beta-catenin and Plakoglobin in Cell-cell Adhesion:Isolation of betacatenin/plakoglobin-deficient F9 Cells［J］.Cell Struct Funct，2005，30(2):25-34.

［24］Shen XD，Kramer RH.Adhesion-mediated squamous cell carcinoma survival through ligand-independent activation of epidermal growth factor receptor［J］.Am J Pathol，2004，165(4):1315-1329.