氨基胍對兔受損視神經的保護作用

胡麗榮，王景春，肖 倩，李金明，楊 峰，王福海

(1河北聯合大學附屬醫院，河北唐山 063000;2唐山市豐潤區人民醫院)

視神經損傷是常見的眼外傷，常致患者視力部分或完全喪失，目前缺乏有效的治療措施。視神經損傷后的修復是近年來國內外學著較為關注的問題。大量實驗證明，一氧化氮(NO)在誘導神經退行型變過程中發揮著重要作用。生物體內的NO是以左旋精氨酸和分子氧為底物，在一氧化氮合成酶(NOS)的作用下生成瓜氨酸并釋放出NO。氨基胍(AG)是NOS的相對特異性抑制劑。2011年7～8月，我們觀察了AG對兔受損視神經的保護作用，旨在為臨床視神經損傷的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 健康大白兔44只，由我院動物實驗中心提供，雌雄不限，體質量2.0～2.5 kg。眼結膜無明顯充血水腫，角膜透明，瞳孔等大等圓，對光反射靈敏。實驗性飼養3 d后，隨機分為對照組4只、損傷組和治療組各20只。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制備及干預 損傷組及治療組制作視神經損傷模型:用濃度1 g/L的烏拉坦，劑量5 mg/kg，兔耳緣靜脈注射麻醉后，將兔俯臥固定于專用的兔臺上，手術顯微鏡下剪開外眥5 mm，縫線開瞼，于顳上方角膜緣處剪開球結膜，在上直肌、外直肌的肌止端做牽引縫線，將眼球牽向鼻下方，鈍性向球后分離，暴露視神經，用中號顯微血管夾(上海醫療器械公司生產，夾持力98 g)，在球后3 mm處夾持視神經20 s，制成視神經損傷模型［1］。經檢查，兔眼球無明顯突出，眼瞼閉合完全，術眼瞳孔散大，直接光反射遲鈍或消失，眼底檢查無視網膜出血及血管梗塞。用妥布霉素沖洗術野，縫合球結膜及外眥，術眼滴氯霉素眼藥水，涂紅霉素眼藥膏。對照組不作任何處理，治療組于造模后24 h內給予AG 100 mg/kg，腹腔內注射，2次/d;損傷組予等量鹽水10 mL/kg，2次/d。

1.2.2 視網膜NO濃度及凋亡細胞檢測 造模后第1、3、7、14、21 天選取兔 4 只(8 只眼)擊頭處死，迅速摘取眼球，去除眼前節，在顯微鏡下剝離視網膜。其中6只眼用硝酸還原酶法檢測視網膜NO濃度(用硝酸還原酶特異性的將NO－3還原為NO－2，再通過其顯色深淺推算出NO的濃度)。具體操作及結果計算按NO試劑盒說明書進行。治療組及損傷組取另2只眼用4%多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋，切片，行凋亡細胞原位缺口末端標記法(TUNEL)染色，操作按試劑盒說明書進行，鏡下觀察計數凋亡細胞數及TUNEL染色陽性細胞數。典型的陽性(凋亡)細胞為細胞皺縮，核固縮或破裂，著色深呈棕黃或黃褐色，核邊或可見凋亡小體。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件，應用方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 各組視網膜NO濃度 見圖1。由圖1可見，損傷組和治療組造模后第 1、3、7、14、21 天視網膜NO濃度均明顯高于對照組，治療組均明顯低于損傷組，P均 ＜0.05。

2.2 各組視網膜凋亡細胞數比較 見圖2。由圖2可見，損傷組和治療組造模后第 1、3、7、14、21 天視網膜凋亡細胞數均明顯高于對照組，治療組均明顯低于損傷組，P 均 ＜0.05。

圖1 三組NO濃度比較

圖2 三組凋亡細胞數比較

3 討論

臨床上常見的視神經損傷多為瞬間外力造成的間接非橫斷性損傷，可發生在任何部位，多為視神經纖維的挫傷，傷后常伴視力立即下降或遲發減退至喪失。本研究視神經損傷模型造成視神經纖維的部分挫傷，無橫斷，類似于臨床上最常見的視神經損傷，在整個操作過程中致傷部位、力度和時間一致，可制作穩定的視神經損傷模型，且具有操作簡便、可控性及重復性等優點。

NO是一種無機小分子氣體，在機體內廣泛存在，易彌散通過細胞膜。生物體內NO的作用有雙面性，一方面其作為一種神經遞質和免疫活性物質，產生多種生物學效應;另一方面，過量的NO對機體具有毒性作用，參與神經系統的多種病理損傷過程，可介導神經元及膠質細胞的凋亡［2，3］。體內的NO在NOS的作用下生成，現已確認的NOS有三種亞型，即神經元型、內皮細胞型、誘導型(iNOS)。研究表明，iNOS是一種僅在病理狀態下才會表達的非鈣離子依賴性酶，主要在視網膜受創傷、缺血、感染等因素誘導下產生，參與機體的病理生理過程。本研究損傷組和治療組造模后第1、3、7、14、21天視網膜NO濃度均明顯高于對照組，治療組均明顯低于損傷組，說明NO在視神經損害過程中發揮作用。由于iNOS RNA半衰期特別長，可持續長時間翻譯合成iNOS，產生NO的量較大，對視網膜的損傷也特別大［4］，因此研制高選擇性、高效、低毒的 iNOS抑制劑尤為重要。

AG為無毒小分子物質，是一類具有親核作用的肼化物。Corbett等于1992年首次報道其具有高選擇性抑制iNOS的作用，是近年研究較多的iNOS抑制劑。本研究發現，損傷組和治療組造模后第1、3、7、14、21天視網膜凋亡細胞數均明顯高于對照組，治療組均明顯低于損傷組，說明AG對受損的視神經有保護作用。AG對視神經損傷后RGCs保護性作用機制主要有:①與iNOS催化部位的血紅素鐵可逆性結合，從而改變其活性基團的構象［5］，而使iNOS失活，因為AG也以這種方式失活其他含鐵或含銅酶。Bryk等從分子機制角度研究了AG的作用原理，發現AG通過在活性位點與血紅素殘基共價結合，并將被修飾的亞鐵血紅素殘基以共價鍵結合于蛋白的活性位點而對iNOS起抑制作用。②AG除在蛋白質水平對iNOS起明顯抑制作用外，還可明顯抑制iNOS mRNA的表達，這與Kobayashi等［6］研究結果相似。③AG酰肼集團與不同的內源性羥基代謝產物和潛在有害的醛結合［7］。AG可通過抑制iNOS表達進而抑制NO的釋放［8］，并對iNOS的抑制作用具有持續性，對周圍神經系統的神經有保護性作用。④AG可以產生大量自殺產物來抑制iNOS。與非選擇性iNOS抑制劑比較，AG在抑制iNOS病理性表達的同時，很大程度上保留了構成型NOS 的生理功能［9］。Arthur等［10］報道，在視網膜缺血和再灌注損傷的動物模型中給予AG，神經保護作用明顯好于未給藥組，而且AG對心、腦、腎及血壓的影響很小，對眼壓無任何影響。

總之，AG是目前發現的一種高選擇性，高效，低毒的iNOS抑制劑，對受損神經有保護性作用。本研究結果為臨床視神經損傷的治療提供了新的思路。

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