微創血腫清除術對大鼠腦出血灶周圍組織TNF-α、IL-1β 表達的影響

(山東大學附屬省立醫院，濟南 250021)

腦出血是一種病死率和致殘率很高的疾病，出血后可由多種細胞因子引起細胞死亡，導致繼發性腦損傷。微創血腫清除術是目前治療腦出血的重要手段，其能快速緩解血腫壓迫、減輕血腫釋放物對周圍腦組織的損傷。2010年11月～2011年3月，我們觀察微創穿刺前后大鼠腦出血灶周圍TNF-α、IL-1β水平變化，探討其影響及可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年Wistar大鼠90只，雄性，體質量260～320 g，購自山東大學醫學院實驗動物中心(許可證:SCXK魯20030004)。大鼠腦立體定向儀(STOELTNGCO.620WHEATLANE 型，美國);微量注射儀(瑞沃德生命科技有限公司);微量注射器10 μL(上海高鴿工貿有限公司);IL-β、TNF-α 抗體(均為非結合多克隆兔抗體)，SP免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒(北京博奧森生物技術有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制備及干預 將90只大鼠隨機分為模型組、微創組及對照組各30只。模型組及微創組參照Rosenberg等［1］報道的方法制備腦出血模型:術前禁食，自由飲水;10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔麻醉，大鼠俯臥位固定在立體定位上，沿頭皮正中切一長約10 mm切口，無菌操作暴露前囟，于前囟前0.2 mm中線旁開3 mm處鉆一直徑為0.5 mm的小孔，進針深度為5.5 mm(尾殼核位置)。剪尾取血，在8 min內用微量進樣器緩慢注入50 μL自體未抗凝動脈血，注血結束后留針10 min后緩慢退針，局部用骨蠟封閉后縫合皮膚。對照組只開顱，不進行任何其他操作。模型制作成功(Bederson評分［2］≥2分;0分為無神經功能缺損;1分為前肢出現屈曲，即提尾懸空試驗陽性;2分為一側推抵抗力下降，即側向推力試驗陽性，伴前肢屈曲，無轉圈行為;3分同2級行為，伴自發性旋轉即提尾懸空試驗陽性)后4 h，模型組不進行干預，分別于各個時間點斷頭取腦;對照組靜注向顱內注射生理鹽水50 μL，手術方法同模型組;微創組將大鼠重新麻醉后固定在定位儀上，坐標值同前，用頭皮針連接微量注射器抽取尿激酶 10 μL［3，4］，沿鉆孔處進針深約 6.3 mm，緩慢注入尿激酶，5 min內注完，等待約45 min后用1 mL注射器代替微量注射器連接真空管外端，利用負壓輕柔緩慢抽吸，抽吸量約為總量的30% ～40%，緩慢退針常規創口消毒后縫合皮膚。所有操作均在無菌條件下進行。術畢將大鼠放回籠中飼養，自由活動進食進水。

1.2.2 出血灶周圍組織 TNF-α、IL-1β 表達檢測模型制作后各組在各個時間點后6、12、24、48、72 h再次行戊巴比妥(0.1 mL/100 g)腹腔麻醉。開胸，暴露心臟及主動脈，用事先磨好的鈍頭50 mL注射器針頭從左心室尖插入心室，并進入主動脈，動作輕柔，防止戳破心室及主動脈。手術剪將右心耳剪開，將37℃ 0.9%氯化鈉溶液從50 mL注射器緩慢推入動物的體循環，持續3～5 min(200 mL)至右心耳流出的液體基本無色，將灌流液換4%多聚甲醛磷酸緩沖液，繼續灌流5 min(約250 mL)。大鼠斷頭取血腫靠近皮層側腦組織約2 mm×2 mm×2 mm，留大腦置于4%多聚甲醛后固定24 h以上。取出固定液中腦組織標本，常規脫水、石蠟包埋、固定，取尾狀核組織制作平面切片，免疫組化法檢測TNF-α、IL-1β表達水平。

1.3 統計學方法 采用SPSS18.0統計軟件，計量數據以±s表示，組間比較用t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

三組 TNF-α、IL-1β 表達見表1。

3 討論

表1 各組不同時點TNF-α、IL-1β表達水平比較(n=30，陽性細胞數，±s)

表1 各組不同時點TNF-α、IL-1β表達水平比較(n=30，陽性細胞數，±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與模型組比較，△P ＜0.05

組別6 h 12 h 24 h 48 h 72 h模型組TNF-α 7.31 ±0.34* 23.24 ±0.81* 28.17 ±0.63* 21.26 ±0.55* 17.06 ±0.52*IL-1β 20.37 ±4.16* 37.58 ±4.34* 44.29 ±4.21* 55.32 ±4.26* 73.71 ±3.98*微創組TNF-α 4.23 ±0.51△ 14.13 ±1.23△ 16.21 ±0.93△ 13.26 ±0.52△ 11.48 ±0.73△IL-1β 13.23 ±3.35△ 26.44 ±3.21△ 34.47 ±3.43△ 43.83 ±3.39△ 58.56 ±3.15△對照組TNF-α 2.32 ±0.30 2.51 ±0.51 3.25 ±0.43 2.96 ±0.28 2.08 ±0.35 IL-1β 11.05 ±5.30 17.32 ±3.20 21.61 ±4.08 25.91 ±3.8124.35 ±4.28

經典理論認為，腦出血后血腫逐漸增大產生的對正常腦組織的機械壓迫，可導致血腫周圍腦組織功能缺損，同時造成顱內壓增高，大腦遠隔部位受到影響。近年研究表明，自發性高血壓性腦出血后，由于釋放凝血酶、細胞毒性物質及其他分解產物，造成炎癥細胞浸潤，從而導致腦水腫及神經細胞凋亡，進而炎性因子的釋放引起附近腦組織損害，進一步造成血腦屏障的破壞［5，6］。急性期出血灶周圍腦組織表達包括TNF-α、IL-1β等在內的多種炎性細胞因子。TNF-α是一種具有廣泛生物學功能的細胞因子，其通過促進凝血、增加內皮細胞通透性及誘導黏附分子或其他炎性介質等表達，增加血腦屏障的通透性，加重腦損傷。IL-1β是觸發免疫和炎性反應的重要介質，可以通過刺激內皮細胞表達白細胞黏附分子，使白細胞聚集于缺血腦組織，從而加重腦缺血損傷。資料表明，IL-1β作為一種炎癥和免疫源性細胞因子，不僅能夠協同其他細胞因子促進B、T細胞活化，且能誘導其他炎性介質的產生，黏附分子的表達，增加白細胞浸潤，促進NOS生成，使NO合成增加，誘導興奮性氨基酸和自由基產生，啟動多種細胞因子級聯反應。炎癥細胞因子在腦出血后腦水腫和腦損傷中所起的作用日益受到重視。

腦出血的治療一直是神經內外科的重點和難點。外科治療可挽救重癥患者生命，但術后死亡率較高。盡可能多清除血腫、少損害正常組織、術后無感染和再出血是未來治療腦出血的發展方向，近年開展的顱內血腫微創清除技術順應了這種發展趨勢。微創穿刺治療操作簡便，可以早期清除血腫，降低顱內壓，避免腦疝形成，有利于腦功能康復，具有創傷小，費用少，不易損傷神經，術后康復快，技術易掌握等優點［7］。我國開展微創穿刺治療腦出血技術廣泛，技術已較為成熟，急性期臨床療效肯定［8，9］，但最佳時機的選擇尚無定論。單從手術角度考慮，血腫抽吸的理想時間為出血后4～8 d，這時血腫大部分液化，有利于清除，但是，這個階段血腫對腦組織的壓迫時間過長，腦損傷恢復可能性小，故遠期療效不佳。本研究選擇在腦出血后4 h左右作為抽吸時間點，血腫周圍的腦組織受損時間短，一旦血腫壓迫效應解除，可以在盡早有效解除血腫對周圍組織的壓迫和血腫液分解產物引起的繼發性損害，挽救血腫周圍的半暗帶，神經功能恢復可能性較大。本研究模型組 6、12、24、48、72 h TNF-α、IL-1β水平明顯高于對照組及微創組，對照組與微創組各時點比較均無統計學差異。提示盡早進行微創清除血腫可以減輕血腫周圍組織炎癥反應，保護神經組織。

綜上，超早期進行微創血腫抽吸術可早期解除血腫壓迫，降低血液分解物對神經細胞的損害作用，減少出血灶周圍TNF-α、IL-1β的表達，從而減輕腦水腫，最大限度降低腦出血后神經功能的缺失，有利于神經功能早期恢復。

［1］Rosenberg GA，Mun-Bryce S，Wesley M，et al.Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats［J］.Stroke，1990，21(5):801-807.

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［8］劉振華，郝茂林，潘寧.顱內血腫穿刺清除術治療老年高血壓腦出血的臨床研究［J］.中國現代神經疾病雜志，2007，7(5):465-466.

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