旋毛蟲A200711蛋白的原核表達、純化及其對H7402細胞增殖的影響

李慧萍，劉 學，張馨月，郭 恒，趙麗晶，劉 攀，孫樹民，褚麗新，劉 娟，劉明遠＊，王學林＊

（吉林大學1.人獸共患病研究所，吉林 長春 130062；2.白求恩醫學院）

旋毛蟲A200711蛋白的原核表達、純化及其對H7402細胞增殖的影響

李慧萍1，劉 學1，張馨月1，郭 恒1，趙麗晶2，劉 攀1，孫樹民1，褚麗新1，劉 娟1，劉明遠1＊，王學林1＊

（吉林大學1.人獸共患病研究所，吉林 長春 130062；2.白求恩醫學院）

目的 原核表達旋毛蟲抗腫瘤基因A200711，并純化該蛋白，CCK-8檢測其對H7402人肝癌細胞的生長抑制作用。方法PCR獲得A200711基因片段，構建重組表達載體pET-28a（＋）-A200711，轉入大腸桿菌Rosetta（DE3）。SDS-PAGE及Western blot檢測IPTG誘導后重組菌，采用Ni-NTA親合層析柱純化并柱上復性目的蛋白。細胞計數試劑盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）檢測A200711蛋白對H7402細胞的生長抑制作用。結果成功構建了原核表達載體pET-28a（＋）-A200711，目的蛋白以包涵體形式在大腸桿菌中高效表達；SDS-PAGE及 Western blot分析顯示，相對分子量約22KD處出現目的蛋白條帶，與理論值相符；經Ni-NTA親合層析柱獲得了高純度可溶性的A200711蛋白；H7402細胞增殖抑制率與A200711蛋白濃度存在量效關系，同時隨作用時間的延長增殖抑制率也明顯增加。結論成功克隆、表達并純化了旋毛蟲A200711蛋白。A200711蛋白可抑制H7402細胞的增殖，且呈現時效和量效關系，本研究表明旋毛蟲A200711蛋白作為潛在的抗肝癌生物制劑有進一步研究的價值。

book=195,ebook=83

旋毛蟲；抗腫瘤；A200711基因；原核表達

（ChinJLabDiagn，2012，16：0194）

旋毛形線蟲（Trichinellaspiralis，Ts.）引起的旋毛蟲病是一種呈世界分布的人獸共患寄生蟲病。該蟲是一種食源性人獸共患寄生蟲，可感染人及150多種動物，對人畜危害很大。感染旋毛蟲的病人出現持續性高熱、肌肉疼痛、面部浮腫等癥狀［1，2］。旋毛蟲肌幼蟲寄生于肌纖維內，一般形成包囊，研究發現旋毛蟲包囊的形成過程類似于宿主肌細胞在凋亡調控下的細胞修復過程，并且腫瘤細胞的凋亡信號調控機制與旋毛蟲包囊形成機制非常相似［3］。Apanasevich VI發現長期感染旋毛蟲肌幼蟲的雌Swiss鼠的乳腺癌的發生率明顯低于未感染鼠［4，5］。吉林大學王學林等研究發現旋毛蟲蟲體粗蛋白對H7402細胞體外有明顯抑制作用，褚麗新等發現旋毛蟲A200711基因真核轉染后對H7402細胞有促凋亡作用［6］，因此旋毛蟲體內可能存在調控腫瘤細胞凋亡的未知蛋白。本研究利用實驗室前期從旋毛蟲成蟲的T7噬菌體展示文庫中釣取到能夠與人肝癌細胞（H7402）和人白血病細胞（K562）結合的一致DNA序列A200711設計引物，以旋毛蟲成蟲cDNA為模板PCR擴增全長A200711基因，構建原核表達載體，在大腸桿菌中誘導表達了C端帶有6×His標簽的A200711重組蛋白，并利用Ni-NTA親合層析柱對表達產物進行了純化和柱上復性，CCK-8試劑盒檢測A200711蛋白對人肝癌細胞H7402增殖的影響，為該基因的抗腫瘤功能研究奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

旋毛蟲cDNA文庫，大腸桿菌菌株JM109，原核表達載體pET28-a（＋），DE3菌株，旋毛蟲感染豬26天血清均由本實驗室保存，羊抗豬二抗為santa公司產品；限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ為MBI產品；pMD-18T載體、T4DNA連接酶和Taq DNA聚合酶為Takara公司產品；DNA片段純化回收試劑盒和質粒抽提試劑盒為Axygen公司產品。Ni-NTA親合層析柱購自GE公司；苯甲基磺酰氟（PMFS）、L-精氨酸、氧化型谷胱甘肽（GSSG）、還原型谷胱甘肽（GSH）均為SIGMA公司產品；人肝癌細胞H7402購于中國科學院生化細胞所，CCK-8試劑盒為日本同仁化學產品。

1.2 方法

1.2.1 pMD-18T-200711克隆載體的構建 根據已獲得的A200711基因的核酸序列設計引物P1（CGC GGA TCC CTG ATG ACA TCT AAT GAA TTT）及 P2（TTA CTC GAG ATC AGA CAA TGT TGG TGA CAC CTT），上下游酶切位點分別為BamHⅠ和XhoⅠ（下劃線部分）。以旋毛蟲cDNA為模板，P1、P2為引物，PCR擴增目的片段，反應條件為：94℃5min，94℃30s，55℃30 s，72℃45s，30個循環；72℃5min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，DNA膠回收試劑盒回收目的片段。T4連接酶催化，回收片段與BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后線性的pET-28a（＋）載體連接，再轉化至感受態大腸桿菌（Rosetta）DE3，涂硫酸卡那霉素平板，37℃過夜培養。篩選陽性菌挑取單菌落接種于5ml LB培養基（含50mg／L硫酸卡納霉素）試管中，37℃震蕩過夜。收集菌體提取質粒DNA，經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定并進行序列測定（序列測定由華大中天生物技術有限公司完成）。

1.2.2 旋毛蟲A200711蛋白的誘導表達、鑒定 取鑒定正確的重組菌5μl接種于5ml LB培養基中37℃過夜培養，取對數生長的大腸桿菌以1%的濃度接種于1L抗性LB中，當OD600達到0.4－0.6時（約3h）加入終濃度為1mM IPTG 37℃表達6h后進行Western blot鑒定，一抗為旋毛蟲26天陽性血清，二抗為羊抗豬抗體（1∶5 000）。

1.2.3 A200711抗腫瘤蛋白的分離純化 1L菌液4℃3 000rpm，離心30min，沉淀用40ml PBS重懸，反復凍融三次后超聲破碎（工作5s，間歇4s，全程1h）。4℃10 000r／min，30min離心超聲后樣品，沉淀為包涵體，用Buffer A［2M 尿素2%Triton X-100（v／v），0.1mM PMSF］反復洗三次后重懸于Buffer B（20mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，20 mM 咪唑，0.5ML-精 氨 酸，1mM GSH，1mM GSSG，pH 7.4）5ml，4℃過夜。上清16 000rpm 4℃離心15min，最后經0.22μm過濾后為待純化樣品。用快速蛋白液相色譜儀（FPLC，?KTA，GE）按照GE公司提供的操作說明書進行柱上純化復性。

圖1 A200711基因PCR結果

圖2 雙酶切鑒定結果

1.2.4 A200711蛋白對H7402細胞增殖的影響人肝癌細胞株H7402分別置于含10%胎牛血清，青、鏈霉素各100UI／ml的DMEM培養液中，37℃，5%CO2培養箱內培養，每2d換液，取對數生長期細胞進行實驗。消化貼壁培養的細胞，制備單個細胞懸液，計數5×103個于96孔板。每個樣品設置3個平行孔，培養24h，更換培養液，分別加入終濃度為2.5，5.0，7.5，10.0，12.5μg／ml的 A200711蛋白，培養24、48、72h后吸棄上清。用DMEM培養液緩慢沖洗孔板2次后，每孔加入DMEM培養液100μl，后加入10μl的CCK-8試劑，同時設無蛋白組為陰性對照，無細胞無蛋白組為空白孔。繼續培養1h后用酶標儀測定吸光度（A）值，測定波長為450nm。根據細胞存活率評價不同濃度A200711蛋白對細胞生長的影響，結果按以下公式計算：細胞存活率（%）＝（實驗組A均值－空白孔A值）／（對照孔A值－空白孔A均值）×100%。

2 結果

2.1 pET-28a（＋）-A200711表達載體的構建

PCR產物電泳顯示，大約在450bp處出現目的條帶，與預期大小相符，見圖1。目的片段連接到pET-28a（＋）載體后提質粒經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切可見目的條帶（圖2），測序結果顯示成功構建表達載體pET-28a（＋）-A200711。

2.2 旋毛蟲抗腫瘤蛋白的誘導表達及鑒定

1L菌液在1mM IPTG條件下誘導表達不同的時間（0、2、4、6、8h），取10μl菌液進行 SDSPAGE電泳，與未加IPTG誘導的菌液比較，在約21KD處出現目的條帶，Bandscan 5.0凝膠圖像分析軟件顯示，IPTG誘導6h時蛋白表達量最高，目的蛋白達菌體總蛋白的35.8%，見圖4。Western blot結果顯示，在約22KD大小處出現一條與理論相符的陽性條帶，見圖3。

圖3 Western blot結果

圖4 親和層析法純化結果

2.3 旋毛蟲抗腫瘤蛋白的分離純化

經Ni-NTA親和層析柱過濾后分離得到分子量為21KD的純化蛋白，通過梯度柱上復性可見洗脫下來單一的目的峰，洗脫下來的目的蛋白經過3KD超濾管可以起到進一步的純化效果，見圖4。

2.4 CCK-8檢測A200711蛋白對H7402細胞增殖調節作用

A200711蛋白對體外培養的肝癌細胞H7402的活力影響見圖5。結果表明，5.0μg／ml的A200711蛋白可明顯抑制細胞增殖（P＜0.05），在48h時的抑制率為27.35±1.12%，且細胞抑制率隨著劑量的增加而增加。

圖5 A200711蛋白對H7402細胞增殖抑制作用

3 討論

寄生蟲和宿主細胞的共生使得寄生蟲也參與到宿主細胞的分化和凋亡信號傳導過程中。由于旋毛蟲包囊的形成，宿主衛星細胞的分化過程中也涉及到細胞凋亡和抗凋亡的機制。感染旋毛蟲的骨骼肌細胞的細胞周期會停滯在G2／M期，同時骨骼肌細胞的特有基因表達水平均降低［7］。近年有研究表明旋毛蟲感染后會引起衛星細胞中c-Ski腫瘤抑制因子表達量的上調［8］。Boonmars等發現在包囊形成過程中線粒體凋亡途徑相關因子Bax、Apaf-1、Caspase 9表達上升，同時死亡受體途徑相關因子TNF-ɑ、TNFR I、Caspase 8和Caspase 3表達上調。說明旋毛蟲分泌物有可能通過以上兩條途徑誘導感染細胞發生凋亡［9］。

本研究所采用的pET 28a（＋）載體是pET系統中應用最廣泛的一員，具有2個6＊His標簽可以自行選擇將His標簽加在目的蛋白的N端或C端，可以采用鎳柱進行純化，操作簡便成本低廉。實驗采用的宿主菌Rosetta（DE3）是BL21的衍生菌，補充大腸桿菌缺乏的6種稀有密碼子對應的tRNA，明顯改善大腸桿菌中由于稀有密碼子造成的表達限制，提高了真核生物基因的表達水平。本研究結果表明，純化復性后的A200711蛋白對H7402細胞增殖有明顯的抑制作用，且抑制作用呈現劑量-時間效應關系。細胞增殖的反向選擇就是細胞死亡，細胞增殖和死亡之間微妙的平衡似乎都是通過細胞增殖刺激物導致細胞程序性死亡或凋亡的激活來進行調節［10，11］。細胞凋亡在腫瘤細胞的生存過程中扮演著關鍵角色，是當今最熱門的研究課題之一。本研究通過CCK-8檢測發現：A200711蛋白對H7402肝癌細胞生長抑制具有顯著的劑量效應關系。A200711蛋白可能通過對細胞凋亡的誘導，在一定程度上對H7402肝癌細胞增殖進行抑制，為以后旋毛蟲抗腫瘤的機理研究提供了客觀的實驗數據。

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Effect on proliferation of H7402cell treated with A200711protein from Trichinella spiralis by prokaryotic expression and purification

LIHui-ping，LIUXue，ZHANGXin-yue，etal.（InstituteofZoonosis，JilinUniversity，Changchun130062，China）

ObjectiveA200711protein fromtrichinellaspiraliswas expressed and purified in E.coli Rosetta（DE3）.Growth inhibition of H7402human liver cancer cells co-cultured with A200711protein was detected by CCK-8.MethodsIn order to express A200711gene in E.coli，the PCR product of 457bp A200711fragment was cloned into prokaryotic expression vector pET-28a（＋）with BamHⅠand XhoⅠ，The recombinant pET-28a（＋）-A200711then was transferred into E.coli Rosetta（DE3），induced by IPTG，purified and renatured by Ni-NTA affinity column chromatography，detected by SDS-PAGE and Western blot.Growth inhibition of H7402cells treated with the purified A200711protein was analysised by Cell Counting Kit-8.ResultsProkaryotic expression vector of pET-28a（＋）-A200711was constructed successfully，the protein were expressed as inclusion bodies in E.coli after induction with IPTG；SDS-PAGE and Western blot analysis detected the protein at molecular weight of about 22kD.High-purity soluble A200711protein were harvested by Ni-NTA affinity chromatography；CCK-8assay have revealed that A200711had the inhibitory effect on cell proliferation（P＜0.05）.ConclusionTrichinella A200711protein was expressed and purified successfully.These results demonstrate that A200711had the inhibitory effect on H7402cells proliferation and valuable biologics in againsting hepatoma.

Trichinella spiralis；anti-tumor；A200711；prokaryotic expression

1007－4287（2012）02－0194－04

國家自然科學基金資助（30972177）

＊通訊作者

R737.5；Q786

A

2011－07－14）