地高辛標記DNA探針快速篩選腫瘤細胞株基因表達差異

汪永強，殷運忠，李傳達，袁平宗，羅 鵬，婁 沖

（1.內江市第二人民醫院 檢驗科／瀘州醫學院附屬內江醫院，四川 內江 641100；2.重慶醫科大學第一附屬醫院 檢驗科，重慶 400016）

地高辛標記DNA探針快速篩選腫瘤細胞株基因表達差異

汪永強1，殷運忠1，李傳達1，袁平宗1，羅 鵬2，婁 沖1

（1.內江市第二人民醫院 檢驗科／瀘州醫學院附屬內江醫院，四川 內江 641100；2.重慶醫科大學第一附屬醫院 檢驗科，重慶 400016）

目的 建立寡核苷酸探針正向斑點雜交技術，快速篩選不同細胞株同一基因HIF-1a表達差異，探討斑點雜交篩選基因表達的可行性。方法將多種培養腫瘤細胞株提取總RNA后，點樣于尼龍膜上，與地高辛標記的HIF-1a基因探針雜交，結果與半定量RT-PCR結果比較。結果斑點雜交實驗結果與RT-PCR結果一致，無統計學差異（P＞0.05）。結論用隨機引物地高辛標記DNA探針可以快速篩查不同細胞株同一基因表達差異，可以作為研究腫瘤基因表達差異的工具。

地高辛；探針；腫瘤細胞；基因表達

（ChinJLabDiagn，2012，16：0204）

腫瘤的發生與發展的主要病因之一是癌基因的激活或抑癌基因的失活，目前臨床開展的腫瘤標志物主要包括糖類、蛋白質類以及激素類，對基因類腫瘤標志物開展較少，因此，探討和尋找基因類腫瘤標志物的檢測方法已受到廣泛關注［1，2］。缺氧是導致惡性實體腫瘤預后差的主要原因之一，缺氧誘導因子1a（hypoxia inducible factor-1a，HIF-1a）是各種細胞對缺氧應答的一個重要轉錄因子，在多數腫瘤細胞中呈高表達［3，4］，本研究擬用地高辛標記 HIF-1acDNA探針，檢測各類腫瘤細胞株中 HIF-1a mRNA表達水平，并與RT-PCR法比較，探討斑點雜交方法篩選基因表達的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

各類腫瘤細胞株（乳腺癌 MCF-7細胞，宮頸癌HeLA細胞，卵巢癌SKVO3細胞，肝癌HepG2，人白血病細胞株K562細胞）由重慶醫科大學組胚實驗室和檢驗系實驗室保存，地高辛隨機引物標記試劑盒購自Roche公司，PCR相關試劑與RNA提取試劑Trizonl購自TaKaRA大連有限公司，引物參考 文 獻 報 道 設 計［5］：HIF-1a：上 游 5′-CTCAAAGTCGGACAGCCTCA-3′，下游5′-CCCTGCAGTAGGTTTCTGCT-3′；β-actin，上游5′-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3′，下游5′-CTAGAAGCATTTGCGGTCGACGATGGAGGG-3′，由TaKaRA大連有限公司合成。

1.2 各腫瘤細胞株的培養與缺氧處理

貼壁細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養液，37℃、5%CO2條件下常規培養至對數增長期，用胰酶消化后繼續傳代培養；懸浮腫瘤細胞株培養于含10%胎牛血清的RPMI1640培養液中，于37℃、5%CO2條件下常規培養至對數增長期后傳代繼續培養。缺氧處理：將生長狀態良好的各腫瘤細胞置于5%CO2下繼續培養6h后，離心去上清后留沉淀加入Trizonl試劑提取總RNA。

1.3 DIG（地高辛）隨機引物法標記HIF-1a﹑β-actin探針與標記效率的檢測

按照Roche公司提供的說明進行，提取細胞總RNA后，逆轉錄成cDNA，逆轉錄反應條件為：42℃，30min；99℃，5min，加入 HIF-1a﹑β-actin特異性引物做PCR擴增與電泳，最后以膠回收的DNA作為作為隨機引物法標記探針的摸板，將標記好的DNA探針在尼龍膜上，免疫顯色后與陽性探針對比分析探針標記效率。

1.4 斑點雜交

分別取對數生長期的各組腫瘤細胞5×105個，分別提取總RNA后，用分光光度計測定RNA的濃度和純度，依次點在尼龍膜上，每株細胞點一個點，每個樣本點量為2μg，同時每個樣本設β-actin內參對照，每株細胞點一個點，每個樣本點量為2μg，在120℃下干烤固定30min、雜交、免疫顯色均按說明書進行。

1.5 腫瘤細胞株HIF-1a基因表達的RT-PCR檢測

分別取對數生長期的各腫瘤細胞5×105個，采用Trizol試劑分別提取各組細胞的總RNA。逆轉錄反應條件為：42℃，30min；99℃，5min。PCR反應條件為：95℃2min，95℃35s，56℃35s，72℃50 s，30個循環，最后72℃延伸5min。同時以β-actin作為內參，最后取5.0μl PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳（180v，20min）鑒定，采用凝膠圖像分析儀分別測定每個樣本HIF-1a和β-action條帶的V值（Volume＝平均光密度值×條帶面積），以DL，2000DNA Ladder測定分子量，算出各樣本HIF-1a表達強度Rv＝V［目的基因］／Vβ-action。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 地高辛標記DNA探針的效率檢測

與地高辛標記的標準DNA相比，HIF-1a基因探針可以檢測到0.1pg的mRNA，用此種探針進行斑點雜交，靈敏度較高。如圖1。

圖1 地高辛標記HIF-1aDNA探針效率

2.2 斑點雜交結果

五種腫瘤細胞的RNA提取后，點樣于尼龍膜上，用HIF-1a與β-action探針分別雜交后，每一樣本重復實驗三次，免疫顯示如圖2，Rv值如圖3，乳腺癌 MCF-7細胞 HIF-1a表達的Rv值為0.935；宮頸癌HeLA細胞為0.874，卵巢癌SKVO3細胞為0.797；肝癌HepG2細胞為0.824；人白血病細胞株K562細胞為0.778。

圖2 斑點雜交分析HIF-1a基因的表達

圖3 RT-PCR分析 HIF-1a基因的表達

2.3 PCR檢測結果

五種培養的腫瘤細胞分別提取RNA后，用HIF-1a特異性引物進行RT-PCR擴增，同時以βactin作為內參，最后取5.0μl PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳（180v，20min）（圖3），每一樣本重復實驗三次，圖像顯示灰度值，乳腺癌MCF-7細胞HIF-1a表達的Rv值為0.926；宮頸癌HeLA細胞為0.884，卵巢癌 SKVO3 細胞為 0.782；肝癌HepG2細胞為0.817；人白血病細胞株K562細胞為0.786。如圖4。

2.4 斑點雜交與RT-PCR結果比較

將五種腫瘤細胞中HIF-1a基因表達分別用斑點雜交法與RT-PCR法檢測，其定量值用Rv表示，用配對資料的t檢驗進行統計學分析，結果表明：斑點雜交實驗結果與RT-PCR結果一致，無統計學差異（P＞0.05），如圖4。

3 討論

圖4 用斑點雜交與RT-PCR檢測各種腫瘤細胞HIF-1amRNA表達Rv值

缺氧誘導因子HIF-1是在缺氧條件下廣泛存在于人和哺乳動物的異源二聚體轉錄因子，由HIF-1a和HIF-1β構成，HIF-1β在低氧環境和常氧環境下在細胞核均有表達，當環境氧濃度＞5%時，HIF-1a上的氧依賴降解區與E3泛醌連接酶結合通過泛素蛋白酶體途徑將HIF-1a迅速降解，當細胞處于缺氧環境下時，阻礙了泛素蛋白酶對HIF-1a的降解作用致使細胞質內HIF-1a積聚增加，因此，HIF-1a是HIF-1的氧調節亞單位；HIF-1a的主要作用是腫瘤細胞在缺氧環境下誘導腫瘤相關基因過表達，其結果是促進腫瘤血管形成、細胞能量代謝旺盛、腫瘤轉移能力加強。目前已有大量文獻報道HIF-1a基因在乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌等實體腫瘤中均過表達，并且與凋亡抑制蛋白等有良好的相關性，表明HIF-1a是腫瘤細胞在缺氧環境下惡性增殖與轉移的主要原因之一，因此檢測HIF-1a的表達有助于了解腫瘤細胞惡性增殖與轉移情況［6］。

本研究通過提取細胞總RNA，經逆轉成cDNA后，用HIF-1a特異性引物擴增該模板，膠回收擴增DNA片段，采用地高辛隨機引物標記方法標記HIF-1a基因DNA探針，通過標記效率檢測發現：該探針可以檢測到樣本中0.1pg的mRNA，說明標記效率與靈敏度都較高。此標記方法的優點是不需要將標記產物分離與純化，操作非常簡便，另外，由于標記的是DNA探針，因此標記好的探針可以回收后反復利用，有效避免了RNA探針容易降解的缺點。經過本實驗表明：回收的探針用于分子雜交并不會影響實驗的靈敏度與雜交背景。為了比較斑點雜交方法檢測腫瘤細胞基因表達的可行性，本研究將五種培養的腫瘤細胞（乳腺癌MCF-7細胞、宮頸癌HeLA細胞、卵巢癌SKV3細胞、肝癌HepG2細胞與人白血病細胞株K562細胞）分別提取RNA后，同時用RT-PCR方法與斑點雜交方法進行檢測HIF-1amRNA的表達水平，結果顯示兩種檢測基因表達的方法無統計學意義（P＞0.05），說明斑點雜交檢測基因表達是可行的。此外，由于分子雜交方法的特異度明顯高于基因擴增方法，所以分子雜交還可以檢測基因突變等現象，可以有效篩選出腫瘤突變基因的存在。

本研究成功制備了地高辛標記的HIF-1a基因探針，建立了腫瘤細胞中顯示基因表達差異的方法，為下一步研究HIF-1a基因的功能奠定了方法學基礎。

［1］Dong Xu，Xu-fen Li，Shu Zheng，et al.Quantitative real-time RTPCR detection for CEA，CK20and CK19mRNA in peripheral blood of colorectal cancer patients［J］.J Zhejiang Univ Sci B，2006，7：445.

［2］D R Emlet，R Schwartz，K A Brown，et al.HER2expression as a potential marker for response to therapy targeted to the EGFR［J］.Br J Cancer，2006，94：1144.

［3］Alexandros Daponte，Maria Ioannou，Ilias Mylonis.Prognostic significance of Hypoxia-Inducible Factor 1alpha（HIF-1alpha）expression in serous ovarian cancer：an immunohistochemical study［J］.BMC Cancer，2008，8：1186.

［4］Arno Kuijper，Petra van der Groep，Elsken van der Wall，et al.Expression of hypoxia-inducible factor 1alpha and itsdownstream targets in fibroepithelial tumors of the breast［J］.Breast Cancer Research，2005，7：808

［5］Jie Zhou，Tobias Schmid，Bernhard Bru，et al.Tumor Necrosis Factor－－Causes Accumulation of a Ubiquitinated Form of Hypoxia Inducible Factor-1through a Nuclear FactorB– Dependent Pathway［J］.Molecular Biology of the Cell，2003，14：2216.

［6］程艷香，江敬紅，洛若愚.HIF-1a及其靶基因在宮頸癌組織中的表達［J］.實用癌癥雜志，2009，24：245.

Detection of gene expression difference in tumor cell lines rapidly with DNA probe-labeled by Digoxin

WANGYongqiang，YINYun-zhong，LIChuan-da，etal.（TheSecongHospitalofNeijiangCity／TheAffiliatedNeijiangHospital，LuzhouMedicalUniversity，Neijiang641100，China）

ObjectiveTo estabilish dot blot hybridization technology in the detection of HIF-1agene expression of various tumor cells and to explore the availability of dot blot in screening gene expression difference.MethodsNuclear acid were extracted from a variety of cultured tumor cell lines and spotted on the nylon membrane，dot blot analysis and semi-quantitative RT-PCR were carded out respectively to detect HIF-1agene expression.ResultsThe dot-blot hybridization results are consistent with the RT-PCR.it did not reach the conventional level of statistical significance（P＞0.05）.ConclusionDot blot hybridization with DIG-labeled HIF-1aprobe can be used to screen quickly gene expressing difference in tumor cells and serve as a research tool for tumor gene expression difference.

Digoxin；probe；tumor cells；gene expression

Q786 R730.2

A

1007－4287（2012）02－0204－03

吳階平醫學基金（FWMN-2011L007）

汪永強（1978－），男，檢驗師，碩士研究生，主要從事臨床檢驗診斷學分子診斷方向研究與工作。

2010－05－24）