鈣拮抗劑硝苯吡啶對大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用

谷思洋，鄧立菊，姜宏宇

（1.吉林大學第一醫院 干部病房，吉林，長春 130021；2.大慶龍南醫院，黑龍江，大慶 163453）

鈣拮抗劑硝苯吡啶對大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用

谷思洋1，2，鄧立菊2，姜宏宇1＊

（1.吉林大學第一醫院 干部病房，吉林，長春 130021；2.大慶龍南醫院，黑龍江，大慶 163453）

目的 研究鈣拮抗劑（Calcium antagonists）硝苯吡啶（Nifedipine）對離體大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用。方法30只體重在260-300g的 Wistar雄性大鼠隨機分為三組：對照組、模型組、Nifedipine組（1μmmol／L）。大鼠麻醉后取出心臟，懸掛于Langendorff灌流裝置上行主動脈逆行灌流，制備大鼠離體心臟缺血30min、再灌注120min模型；對照組行150min正常灌流。測定心肌梗死面積，檢測SOD（Superoxidedismutas超氧化物歧化酶）及 MDA（malonaldehyde丙二醛）的含量，免疫組化方法行PKCδ（The protein kinase C蛋白激酶C）的測定，用RT-PCR法測定NCX（Na＋／Ca2＋exchanger鈉鈣交換體）及SERCA2α（Sareoplasmie reticulum calcium adenodine triphosphatase肌漿網鈣泵）的表達。結果硝苯吡啶組心肌梗死面積較模型組明顯縮?。≒＜0.01）；冠脈灌流液中SOD活性明顯升高（P＜0.01）；MDA含量顯著下降（P＜0.01）；藥物組的PKC含量水平較模型組增多（P＜0.05），藥物組 NCX mRNA的表達水平較模型組降低，存在顯著差異（P＜0.05）。結論鈣拮抗劑Nifedipine對大鼠心肌缺血再灌注損傷有保護作用。

硝苯吡啶（Nifedipine）；缺血／再灌注；心肌梗死；鈉鈣交換體（NCX）

（ChinJLabDiagn，2012，16：0210）

本研究采用大鼠離體心肌缺血／再灌注模型，觀察Nifedipine對缺血／再灌注心肌損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 動物與儀器

體重在260-300g的wistar雄性大鼠（吉大動物實驗中心，動物合格證號：SCXK—吉2007-0003）；Langendorff灌流裝置（成都泰盟科技有限公司）；分光光度計（上海尤尼柯有限公司）；BI-2000圖像分析系統（成都泰盟科技有限公司）；OLYMPUS顯微鏡。

1.2 藥品與試劑

1.2.1 硝苯吡啶（Nifedipine），購自瑞士 Enzo life sciences公司。溶于二甲基亞砜（DMSO）中，配成1mmol／L貯備液，分裝成300μl小瓶，4℃冰箱中保存，應用前取出37℃水浴中融化。用KH液稀釋成1μmol／L濃度。

1.2.2 KH 工作液 NaCl 6.92g，NaHCO32.1g，KC1 0.35g，CaC120.2g，MgSO40.14g，KH2PO40.16g，葡萄糖2.0g，加去離子水1000ml，在磁力攪拌機上充分攪拌溶解，溶解后將pH調整為 （7.4±0.5）。

1.2.3 TTC染液 將0.5g TTC粉末加入裝有50 ml 1×PBS液的棕色瓶中，37℃水浴箱中15min，振蕩，制成TTC溶液，現用現配。SOD、MDA試劑盒由南京建成生物公司提供。PKCδ抗體由美國SAB signalway antibody生物工司提供。Trizol、DEPC、M-MLV反轉錄酶、Taq酶（寶生物工程大連有限公司）；引物由上海生工生物技術有限公司合成；其余試劑均為國產分析純試劑。

1.3 實驗方法

1.3.1 離體大鼠心臟Langendorff灌流模型制備

測大鼠體重，以0.4g／kg水合氯醛腹腔麻醉大鼠，腹腔內注入5mg／kg肝素鈉，開胸，迅速摘出心臟置于預先用95%O2＋5%CO2混合氣體（1.5L／min）所飽和的4℃KH液中。經主動脈逆行插管懸掛于Langendorff灌流裝置上，調整懸掛位置使左、右冠脈分別得到充分的灌流，保持自搏心率，在10 kPa恒壓、37℃恒溫下以1.5L／min 95%O2＋5%CO2流量通氣，充分氧合的KH液按10ml／min灌流，剪去左心耳，將充水導管球囊插入左心室，向球囊內注水約0.2－0.4ml，將左心室舒張壓調至1.1 kPa以上，記錄灌流壓、左心室壓力（美國MP150多導電生理記錄儀）及灌流量，穩定后15min后開始心肌缺血再灌注模型的制備。

1.3.2 大鼠心臟缺血／再灌注的模型制備 選擇30 min的不完全缺血（即將左、右冠脈灌流量減到原灌流量的5%）及2h再灌注（10ml／min的KH液）。

1.3.3 試劑稀釋及實驗分組 將預先分裝的硝苯吡啶，用KH液釋成1μmol／L濃度。將30只大鼠隨機分為3組，每組10只。組一：對照組；組二：為模型組；組三：在缺血時向主動脈內注入1μmol／L鈣拮抗劑硝苯吡啶（硝苯吡啶組）。

1.4 檢測指標

1.4.1 SOD、MDA及心肌梗死面積檢測 收集灌流結束前1min的冠脈流液，根據試劑盒測量SOD、MDA的活性。實驗結束時取下心臟放入-20℃冰箱中冷凍1h，然后將心臟以心尖為起點切成1mm間隔橫斷切片，放入37℃氯化三苯基四氮唑（TTC）中染色30min，再置于4%多聚甲醛液中24h，于吉林大學設備處進行實體圖像采集，梗死區（TTC未染色的白色區）和非梗死區 （TTC染成紅色區），然后用BI-2000圖像分析系統計算心肌梗死面積（即梗死面積占全心面積的百分比）。

1.4.2 心肌PKCδ表達 免疫組織化學染色法：取心肌標本4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，做成5μm切片，行HE染色。SP法行PKCδ免疫組織化學染色。切片常規脫蠟至水，置入3%H2O2孵育15 min，以封阻內源性過氧化物酶。PBS浸泡3min×2次；用0.01M檸檬酸鹽緩沖液抗原修復自然冷卻后取出，PBS沖洗3min×2次。滴加山羊血清封阻，室溫下孵育10min。滴加PKCδ一抗（1∶100稀釋）37℃濕盒中孵育75min。PBS沖洗3min×3次。滴加生物素標記的二抗，濕盒中37℃孵育20 min。PBS沖洗3min×3次。滴加辣根過氧化物酶標記鏈酶卵白素，37℃孵育15min。PBS沖洗3 min×3次。DAB顯色1min，自來水沖洗10min，蘇木精復染1min，自來水沖洗10min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在陰性對照切片中，滴加PBS替代PKCδ單克隆抗體，其余步驟不變。心肌PKCδ表達鑒定：細胞呈棕黃色染色者為陽性細胞，利用BI-2000圖像分析軟件分析組化圖片平均光密度值。

1.4.3 NCX與SERCA 2α的 mRNA表達 NCX與SERCA2α行RT-PCR：用Trizol抽提總RNA，測定RNA濃度和純度。取4μg總RNA反轉錄生成cDNA文庫。1μl模板用于目的基因的PCR擴增。引物順序為SERCA2a，上 游 引 物：5′-ATGAGATCACAGCTATG ACTGGTG-3′，下 游 引物：5′-GCATTGCACATCTCTATGGTGACTAG-3′，產物：620bp；NCX，上游引物：5′-AATGAGCTTGGTGGCTTCACA-3′，下 游 引 物：5′-CCGCCGATACAGCAGCAC-3′，產物：861bp；GAPDH（內 參 照 ），上 游 引 物：5′-GCCATCAACGACCCCTTCATTG-3′，下 游 引 物：5′-TGCCAGTGAGCTTCCCGTTC-3′，產物：597bp。反應條件為SERCA2a：94℃ 5min，94℃ 3min，56℃30s，72℃30s，35次循環，72℃ 10min；NCX：94℃ 5 min，94℃3min，53℃30s，72℃30s，35次循環，72℃10min；G APDH：94℃5min，94℃3min，56℃30s，72℃30s，35次循環，72℃10min。取擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統進行灰度掃描，用靶基因／GAPDH表示靶基因mRNA相對表達水平。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 SOD及MDA的影響大鼠離體心臟經過15 min平衡灌注，30min不完全缺血及2h再灌住，冠脈灌流液中，硝苯吡啶同模型組比較，SOD活性明顯升高（P＜0.01），MDA 含量顯著下降（P＜0.01）。見表1。

表1 大鼠離體心臟冠脈流液中SOD、MDA含量比較（±s，n＝10）

表1 大鼠離體心臟冠脈流液中SOD、MDA含量比較（±s，n＝10）

注：與模型組比較，★P＜0.01

組別 SOD（U／ml） MDA（nmol／ml）4.432±2.068 0.703±0.142硝苯吡啶組 5.876±3.047★ 0.517±0.088模型組★

2.2 對大鼠離體心臟心肌梗死面積的影響對照組無心肌梗死出現；硝苯吡啶組梗死面積較模型組明顯減小，與模型組比較差異有顯著性（P＜0.01）。見表2。

2.3 HE染色與PKCδ表達結果心肌組織HE染色后400倍光鏡下見：對照組：心肌細胞排列規則，無間質水腫；模型組：心肌細胞間質水腫，肌纖維腫脹，排列無序，橫紋消失，肌漿內出現空泡變性，可見較多粒細胞灶狀浸潤，并可見少量紅細胞滲漏，個別細胞出現溶解、壞死；藥物組：心肌細胞輕度水腫，界限清楚，細胞排列相對規則，間質無水腫，可見少量中性粒細胞浸潤，無紅細胞滲漏。通過對心肌組織PKC平均光密度的研究發現，對照組的PKC表達水平較低，缺血再灌注組PKC表達較對照組增多，且主要分布于胞漿中；硝苯吡啶組PKC水平較缺血再灌注組藥物組均能使PKC含量增加（P＜0.01），并能使心肌細胞的PKC從細胞核或細胞漿移位到細胞膜上，分布發生改變。見表3。

表2 各實驗組在缺血再灌注損傷中的心肌梗死面積比較（±s，n＝10）

表2 各實驗組在缺血再灌注損傷中的心肌梗死面積比較（±s，n＝10）

注：與模型組比較，★P＜0.01

組別 梗死面積（%）對照組 無模型組 31.6±0.081硝苯吡啶組 21.6±0.091★

表3 心肌組織免疫組化PKC表達平均光密度的比較（±s，n＝10）

表3 心肌組織免疫組化PKC表達平均光密度的比較（±s，n＝10）

注：與正常組比較，●P＜0.01；與模型組比較，★P＜0.01

組別 n 10 0.237±0.018模型組 10 0.296±0.011●硝苯吡啶組 10 0.321±0.014平均光密度對照組★

2.4 NCX及SERCA2αmRNA表達擴增條帶清晰明亮，與預先設計的 NCX、SERCA2α、GAPDH基因片段大小一致 （圖5）。模型組NCX mRNA的表達比正常組顯著升高（P＜0.01）；硝苯吡啶組NCX mRNA的表達水平較模型組降低，存在顯著差異（P＜0.01）。模型組SERCA2αmRNA的表達比對照組顯著降低（P＜0.01）；硝苯吡啶組SERCA2αmRNA的表達水平較模型組顯著增高（P＜0.01）。見表4。

表4 各組NCX1mRNA和SERCA2αmRNA表達比較（±s，n＝10）

表4 各組NCX1mRNA和SERCA2αmRNA表達比較（±s，n＝10）

注：與對照組比較，●P＜0.01；與模型組比較，★P＜0.01

組別 n NCX1／GAPDH SERCA2α／10 0.236±0.059 0.487±0.049模型組 10 0.457±0.068● 0.154±0.053●硝苯吡啶組 10 0.305±0.047★ 0.204±0.041 GAPDH對照組★

3 討論

一般所稱鈣拮抗劑（Calcium antagonists），是指阻滯離子從胞外經鈣通道流入胞內的藥物，能抑制跨膜鈣內流及細胞內的鈣釋放，降低細胞內游離鈣濃度及其利用率，抑制ATP酶的活性，降低心肌收縮力；使平滑肌細胞松弛，血管擴張，降低外周血管阻力［1］。由于鈣拮抗劑增加缺血區血流，負性肌力作用又降低了局部代謝，有利于維持缺血心肌的氧供需平衡，因此可縮小缺血范圍，減輕局部代謝紊亂及再灌注性細胞損害的程度。鈣拮抗劑通過阻斷心肌細胞膜鈣通道，降低細胞內鈣濃度、拮抗鈣超載，治療心肌缺血再灌注損傷已成為目前的一種共識［2－5］。在心肌缺血后壞死尚未形成前給藥效果更佳。有報道證實［6］：應用鈣離子拮抗劑對損傷的心肌細胞有一定的保護作用，對改善心肌功能有明顯的效果。

本實驗為Langendorff灌流裝置上行主動脈逆行灌流，制備大鼠離體心臟缺血30min、再灌注120 min模型，模擬臨床上心肌缺血-再灌注損傷患者的病理生理過程，觀察硝苯吡啶對離體大鼠心臟的保護作用。結果顯示，硝苯吡啶組心肌梗死面積較模型組、對照組明顯縮?。≒＜0.01），藥物對離體大鼠心肌有保護作用。MDA為氧自由基攻擊生物膜不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應的終產物，其值間接反映機體組織細胞受自由基損傷程度；SOD為細胞內一種抗氧化酶，它可清除超氧陰離子，保護機體免受氧自由基損傷，其值間接反映機體清除氧自由基的能力，缺血再灌注時自由基生成增加，同時其清除能力下降，脂質過氧化加強；應用藥物后冠脈灌流液中SOD活性明顯升高（P＜0.01）；MDA含量顯著下降（P＜0.01），證明藥物對大鼠心肌有保護。心肌細胞內游離的Ca2＋濃度升高可直接激活Ca2＋依賴性PKC（a），使其從細胞漿轉移到細胞膜上或通過激活Ca2＋依賴性磷酯酶C使與其相聯的Gq蛋白激活不依賴于鈣的PKC-δ和PKC-ε，使其從胞漿轉移到細胞膜上。PKC的激活可引發底物蛋白質磷酸化、細胞內鈣穩態、線粒體ATP敏感性鉀離子通道、腺苷、緩激肽、受體的信息傳遞等一系列變化，是一種重要的機體內源性保護中間環節，通過催化多種蛋白質磷酸化，進而對細胞產生保護作用，減輕細胞損傷。藥物組的PKC含量水平較模型組增多（P＜0.01）。本研究發現缺血再灌注損傷心肌中PKC的表達較對照組大鼠心肌中測定量高，說明在缺血再灌注后，心肌產生損傷，PKC由靜止狀態轉為激活狀態，表達增多，以保護受損傷心肌。心肌缺血再灌注時，鈉鈣交換體（sodium-calcium exchanger，NCX）反向轉運使Ca2＋內流增加，導致細胞鈣超載，是缺血再灌注造成細胞結構損傷、心律失常和收縮功能障礙的重要機制［7］，正常心臟的NCX1和SERCA2α在細胞水平上保持相對平衡。NCX是缺血／再灌注時 Ca2＋進入細胞的主要途徑［8，9］，阻斷NCX介導的鈣流入可得到良好的心肌保護作用［10］，肌漿網鈣泵（SERCA2α）主要作用是將胞質內Ca2＋攝回至肌漿網內，藥物組NCX mRNA的表達水平較模型組降低，存在顯著差異（P＜0.01），藥物組SERCA2αmRNA的表達水平較模型組顯著增高（P＜0.01），實驗證明使用硝苯吡啶對離體大鼠心肌有保護作用。鈣拮抗劑Nifedipine減輕缺血再灌注心肌細胞損傷，對大鼠心肌缺血再灌注損傷有保護作用。

［1］Zhang WG.Can we use calcium antagonist better in antihypertensive therapy［J］.Pharmacol Res，1996，34（5／6）：187.

［2］Hoffman JJ，Gilbert TB，Poston RS，et al.Myocardial reperfusion injury：etiology，mechanisms，and therapies［J］.J Extra Corpor Technol，2004，36（4）：391.

［3］Moukarbel GV，Ayoub CM，Abchee AB，et al.Pharmacological therapy for myocardial reperfusion injury［J］.Current Opinion In Pharmacology，2004，4（2）：147.

［4］Gao F F，Hao S Y，Shi G G，et al.Cardiac electrophysiological and antiarrhythmic cffects of N-n-buty haloperidol indide［J］.Cell physiolo Biochem，2010，25（4-5）：433.

［5］Huang Z，Shi G，Gao F，et al.Effects of N-n-buty haloperidol indide on L-type calcium channels and intracellular free calcium in rat ventricular myocytes［J］.Biochem Cell Biol，2007，85（2）：182.

［6］劉 穎，程 翔，廖玉華.地爾硫卓對心臟缺血／再灌注后心肌炎癥的影響［J］.中國藥理學通報，2010，2（1）：56.

［7］Christopher RW，Valentino Piacentino Ⅱ，Kenneth SG，et al.Na＋-Ca2＋exchange current and submembrane［Ca2＋］during the cardiac action potential［J］.Circ Res，2002，90（1）：182.

［8］Ohtsuka M，Takano H，Suzuki M，et al.Role of Na＋-Ca2＋exchanger in myocardial ischemia／reperfusion injury：evaluation using a heterozygous Na＋-Ca2＋exchanger knockout mousemodel［J］.Biochem Biophys Res Commun，2004，314：849.

［9］Satoh H，Mukai M，Urushida T，et al.Importance of Ca2＋influx by Na＋／Ca2＋exchange under normal and sodium-loaded conditions inmammalian ventricles［J］.Mol Cell Biochem，2003，242（1-2）：11-17.

［10］Lee C，Hryshko LV.SEA0400：a novel sodium-calcium exchange inhibitor with cardioprotective properties［J］.Cardiovasc Drug Rev，2004，22：334.

Protective Effect of Calcium Antagonist Nifedipine on Myocardial Ischemia-reperfusion Injury in Isolated Rat Hearts

GU Si-yang，DENGLi-ju，JIANGHong－yu.（FirstHospital，JilinUniversity，Changchun130021，China）

ObjectiveStudy the protective effect of Calcium Antagonist Nifedipine，on myocardial ischemia-reperfusion injury in isolated rat hearts.MethodsRat myocardial ischemia-reperfusion injury model was established by consisting of a 30min（reducing perfusion flow level of left and right coronary to 5%of the original irrigation flow）ischemic period and 2hreperfusion，the isolated rat hearts were perfused on modified Langendorff apparatus.The rats were divided into control group，ischemia／reperfusion（I／R）group，Nifedipine group，then detected the myocardial infarct area，the levels of SOD and MDA，and PKCδwere detected by immunoHistochemistry，Semi-quantitative RT-PCR was employed to measure the mRNA levels of NCX and SERCA2a.Results（1）Compared with the I／R group，the myocardial infarct area was significantly lower，（2）SOD activity increased significantly and MDA decreased significantly；（3）Nifedipine group，compared with model group，levels of PKC increased （P＜0.05）；（4）expression of NCX mRNA in Nifedipine group was lower than the model group，there were significant differences（P＜0.05）；expression of SERCA2αmRNA in Nifedipine group was significantly increased compared with the model group（P＜0.05）.ConclusionThe calcium antagonist Nifedipine on myocardial ischemia-reperfusion injury has a protective effect.

book=211,ebook=93

myocardial infarction；Nifedipine；Ischemia-reperfusion；NCX

R364.1

A

1007－4287（2012）02－0210－04

吉林省自然科學基金資助（201115066）

＊通訊作者

2011－01－08）