一種新型凝固劑在固體平板分離極端浸礦菌中應用潛力研究

夏金蘭，潘佳民，鞏三強，金雪潔，聶珍媛，閆藝贏，邱冠周

（1. 中南大學資源加工與生物工程學院，湖南 長沙 410083； 2. 生物冶金教育部重點實驗室，湖南 長沙 410083）

一種新型凝固劑在固體平板分離極端浸礦菌中應用潛力研究

夏金蘭1,2，潘佳民1，鞏三強1，金雪潔1，聶珍媛1，閆藝贏1，邱冠周1,2

（1. 中南大學資源加工與生物工程學院，湖南 長沙 410083； 2. 生物冶金教育部重點實驗室，湖南 長沙 410083）

利用一種新型、耐高溫、耐酸的基質作凝固劑，設計了一種新型的分離純化極端浸礦菌的固體平板培養基。在此基礎上，結合水盤培養法，成功的實現了高溫嗜熱浸礦菌、中等嗜熱浸礦菌以及嗜中溫浸礦菌的固體平板培養及純化。待試驗的三種極端浸礦菌：高溫嗜熱浸礦菌萬座酸菌（Acidianus manzaensis）、中等嗜熱浸礦菌 (Ferroplasma thermophilum L1)、嗜中溫浸礦菌(來自實際礦山酸性礦坑水)都能在此固體培養基表面形成圓形粘液狀米黃色菌落；菌落掃描電鏡結果表明：菌落內部結合較為松散，單個細菌通過胞外附屬結構或物質與培養基基質緊密結合。實驗結果表明該固體培養基在浸礦菌分離純化、菌種鑒定、以及遺傳改良等方面具有廣闊的應用前景。

凝固劑; 固體培養基; 浸礦微生物; 掃描電鏡

近年來，金屬硫化礦的生物浸出技術因其環境友好型以及低成本而成為礦冶技術的研究熱點[1]。目前，生物浸出技術的研究幾乎涉及整個硫化礦、鈾礦、錳礦等。但有工業化應用的僅限于銅、金以及鈾礦。銅、金礦生物浸出產業以初具工業化規模。生物浸出技術作為一項綠色礦產資源綜合利用技術，具備廣闊的應用潛力[2]。

但是，現階段生物浸出技術浸出速率慢，是限制其大規模工業化應用的最主要因素。其關鍵是對浸礦微生物浸礦機理知之甚少以及現有的菌種資源氧化活力低下，其根本原因是沒有很好的方法或固體培養基獲得大量有特色的菌落以供菌株篩選、選育及遺傳特性研究[3]。

近些年來，隨著分子生物學技術和其他相關技術在微生物分離檢測中的應用，越來越多的極端微生物被檢測到，并且隨著研究的深入和技術的進步，許多微生物從不可培養狀態達到了可培養狀態，對新分離純化出的極端菌的性質的研究也取得了許多新進展。但是這些技術由于條件要求苛刻，操作繁瑣，另外獲得的純培養物很難進行遺傳操作，很難在實驗室推廣。因此，大多數研究者依然采用固體培養基分離純化極端微生物。浸礦菌相對其他極端菌而言，固體純培養更加困難，有的學者甚至認為浸礦菌不能實現固體純培養。其難度有三方面:首先是固體培養基難以制作，原因是沒有一種常用的固體凝固劑可適用于自養浸礦菌種；其次是培養基的能源問題，可供選擇的種類太少，尤其是水溶性種類更少，非水溶性在固體培養基中易沉降，分布不均，而且這些種類化學性質多不穩定，易氧化、易分解，不能高溫滅菌，如硫代硫酸鈉、亞硫酸鈉和硫酸亞鐵；三是培養條件要求高，培養溫度高，但生長緩慢，而且要求通氧性好，因此培養基易干燥。其中最難克服、研究最多的是凝固劑[4,5]。

Khalid A M等利用脫乙酞吉蘭糖膠(Gelrite)做凝固劑[6]，由于該凝固劑可減免對浸礦自養菌的抑制作用，有較高的克隆率，而且轉培養性能較好好，因此被認為是目前較理想的凝固劑。但是，到目前為止，國內仍然未完全解決浸礦自養菌固體純培養問題，浸礦菌純培養任然是限制理論與應用研究的“瓶頸”[7,8]。

本論文通過前期大量的探索，找到了一種新型、耐高溫、耐酸的凝固劑[9],在此基礎上，通過大量試驗，設計了一種新型的分離純化極端浸礦微生物的固體平板培養基及培養方法。利用該固體培養基及培養方法，成功的實現了高溫嗜熱浸礦菌萬座酸菌（Acidianus manzaensis）、中等嗜熱浸礦菌（Ferroplasma thermophilum L1）以及嗜中溫浸礦菌(來自實際酸性礦坑水樣品)的固體平板培養及純化，首次獲得浸礦菌在固體培養基表面的菌體形貌圖。菌落以及菌落液體再培養物掃描電鏡結果（見圖2，圖3）進一步證實了該方法的可靠性。結果表明：該培養基具有一定的普適性，在極端嗜熱/嗜酸，中度嗜熱嗜熱/嗜酸及嗜中溫浸礦細菌的分離純化、改良、浸礦機理等研究方面具有廣闊的應用前景。

1 實驗部分

1.1 實驗材料與設備

菌種：高溫嗜熱浸礦菌萬座酸菌（Acidianus manzaensis），最適生長溫度65 ℃,最適pH=1.5（以亞鐵為能源）。中等嗜熱浸礦菌 (Ferroplasma thermophilum L1)，最適生長溫度 45 ℃，最適pH=1.0。菌種由教育部生物冶金重點實驗室提供,嗜中溫浸礦菌(來自實際礦山酸性礦坑水)。

基礎培養基：（9K培養基)3 g/L (NH4)2SO4，0.1 g/L KCl，0.5 g/L K2HPO4，0.5 g/L MgSO4·7H2O，0.01 g/L Ca(NO3)2，0.1 g/L 酵母浸出液。（所有藥品均為分析級，購自天津大茂)。

凝固劑：一種新型、耐高溫、耐酸凝固劑[9]。

儀器與設備：高溫油浴搖床（SHA-GW），隔水式恒溫培養箱（上海一恒-9050），酸度計（SARTORIUS PB-10），自制水盤,掃描電鏡（SEM，JEOLJSM6360 LV）。

1.2 凝固劑相關參數的測定

按照表1設計單因素試驗，初步確定凝固劑凝固條件。

表1 凝固劑相關參數的確定（凝固劑含量、pH、鈍化溫度對凝固劑凝固的影響）Table 1 Determine of coagulator parameters ( Effect of coagulator content, pH and deactivation temperature on the solidification of coagulator )

1.3 培養基的制作及最佳菌落形成條件的確定

按照下述過程制作固體培養基，按照表2優化菌落形成條件。

A液：600 mL蒸餾水，調pH值，加入凝固劑（培養基成分優化見表2）。

B液：9 K營養鹽液350 mL，調pH值、添加硫氰酸鉀、酵母浸出液。

C液：50 mL 9 K營養鹽液中加入一定量的硫酸亞鐵，待其全部溶解后，采用0.22 μm濾膜過濾除菌。

（A、B液121 ℃滅菌20 min，冷卻至80 ℃左右，A、B、C液紗布過濾混合，倒制平板（9 cm)，每板大約25 mL。）

表2 菌落最佳形成條件的優化Table 2 Optimizing conditions for colony formation

1.4 極端浸礦菌平板培養及純化方法

1.4.1 菌種活化

高溫嗜熱浸礦菌萬座酸菌（Acidianus manzaensis）、 中 等 嗜 熱 浸 礦 菌 (Ferroplasma thermophilum L1)，在以 FeSO4·7H2O（22.2 g/L)為能源基質的9 K培養基中進行培養活化，采用血小板計數器計數，待其進入對數生長期，轉接，如此重復3次。

1.4.2 系列稀釋及涂布平板

取對數期的菌種，系列稀釋，分別吸取 1 mL 10-2、10-3稀釋液于固體培養基中，涂布平板。嗜中溫菌 (來自實際礦山酸性礦坑水) 直接吸取 1 mL，涂布平板（設置3個平行，1組空白對照）。

1.4.3 培養方法

平板倒置均勻放入自制水盤，高溫嗜熱浸礦菌萬座酸菌（Acidianus manzaensis）于65 ℃培養，中等嗜熱浸礦菌 (Ferroplasma thermophilum L1) 于52℃培養。每隔24 h，向自制水盤中添加1次水，保持水盤濕度。嗜中溫菌于37 ℃培養。觀察，照片，統計菌落生長情況。

1.4.4 細菌再培養獲得純培養

小心挑取單菌落于液體9 K培養基中進行培養(以 FeSO4·7H2O為能源（22.2 g/L)），重復以上步驟，鏡撿，最終獲得純培養。

2 結果與分析

2.1 凝固劑相關凝固參數

通過初步試驗，確定凝固劑在水作為溶劑的條件下的凝固參數為：凝固劑含量>21 g/L、2.090 ℃。

2.2 培養基的制作及最佳菌落形成條件

綜合考慮到浸礦菌生長的環境條件及實驗室保藏的菌種的最佳生長條件，并參考丁建南，張在海等[6,7]浸礦微生物分離純化方法,設計培養基的配制方法、初始pH以及營養鹽和硫氰酸鉀的大致范圍。

2.2.1 A、B、C液組合方式對培養基凝固性的影響見表3。

表3 A、B、C液組合方式對培養基凝固性的影響Table3 Effect of combination of A,B,C liquid on the solidification of coagulator

2.2.2硫氰酸鉀添加量對培養基凝固效果和菌落形成的影響

采用C組合方式，硫氰酸鉀添加量設置5個濃度梯度，其它成分不變，考察硫氰酸鉀對菌落形成的影響。實驗結果見表4。

表4 硫氰酸鉀添加量對培養基凝固效果和菌落形成的影響Table 4 Effect of additive amount of potassium rhodanide on the solidification of coagulator and colony formation

表4結果表明：在一定濃度范圍之類，硫氰酸鉀對菌落的形成具有促進作用。硫氰酸鉀添加量為6 g/L時，浸礦菌在培養基表面能形成黃色較大的菌落。硫氰酸鉀含量過高時，菌落小且成分散狀，難以形成固著的較大菌落?？赡苡捎诠腆w培養基限制了傳質速率，導致亞鐵的快速氧化和鐵帆的迅速產生，近一步引起培養基局部pH急劇變化，而不利于細菌菌落的形成，加入一定量的硫氰酸鉀，硫氰酸鉀可能與 Fe3+形成絡合物，充當緩沖劑的角色，另一方面，也可以減輕 Fe3+對亞鐵氧化酶的競爭性抑制，從而有利于菌落的形成。而加入過量的硫氰酸鉀，可能K+對細菌具有一定的抑制作用，反而不利于菌落的形成。

2.2.3 硫酸亞鐵添加量對培養基形態和菌落形成的影響

采用 C組合方式，硫酸亞鐵添加量設置五個梯度，其它成分不變，硫氰酸鉀添加量為6 g/L，考察能源底物硫酸亞鐵對菌落形成的影響。實驗結果見表5。

表5 硫酸亞鐵添加量對培養基形態和菌落形成的影響Table 5 Effect of additive amount of ferrisulphas on culture medium form and colony formation

表5結果表明：硫酸亞鐵含量為10 g/L時菌落較大，且數目較多，硫酸亞鐵含量較高或低都不利于菌落的產生?？赡苡捎?，亞鐵濃度過低時，細菌氧化性降低，繁殖速度下降，亞鐵濃度過高時，細菌氧化速率增強，引起細菌接種的局部區域pH 急劇上升，同時Fe3+大幅度增加，所后導致鐵帆大量產酸，使pH急劇下降，而不利于細菌菌落的形成。2.2.4 培養方式對培養基形態和菌落形成的影響

采用C組合方式，其它成分不變，硫氰酸鉀添加量為6 g/L，硫酸亞鐵添加量為10 g/L。探索培養方式對菌落形成的影響。實驗結果見表6。

表6 培養方法對培養基形態和菌落形成的影響Table 6 Effect of culture methods on culture medium form and colony formation

表6結果表明：自制水盤能很好的保持培養基內水分，進而促使菌落的形成。

2.3 細菌再培養獲得純培養

挑取單菌落，進行液體再培養，重復以上步驟，反復鏡檢，直至獲得純培養。細菌再培養實驗及掃描電鏡結果表明：單菌落經過多代再培養后能在合成培養基上形成黃色純菌落（見圖1(a)），菌落直徑>2 mm。浸礦菌與培養基基質通過細胞外附屬結構或物質緊密吸附、整個菌落呈現圓形米黃色粘液狀(見圖2(e))。

2.4 固體培養基及培養方法普適性研究

中等嗜熱浸礦菌 (Ferroplasma thermophilum L1)培養溫度為52 ℃，嗜中溫浸礦菌培養溫度為37 ℃，其它培養基制作與培養條件與嗜高溫浸礦菌一致。通過培養發現中等嗜熱浸礦菌 (Ferroplasma thermophilum L1)、嗜中溫浸礦菌都能在固體平板表面形成與嗜高溫浸礦菌性質相似的菌落（見圖1(b)、(c)）。

圖2 浸礦菌在固體培養基表面單個菌體掃描電鏡圖Fig.2 Single colony scanning electron micrographs of bioleaching bacteria on the solid media surface

圖3 浸礦菌液體培養物電鏡圖片Fig.3 Liquid medium electron micrographs of bioleaching bacteria

3 結 論

（1）采用一種新型耐高溫、低酸凝固劑，設計了一種新型的分離純化極端浸礦微生物的固體平板培養基。優化后培養基配方及制作方法如下：

A液：600 mL蒸餾水，調pH=2.5，加入凝固劑21 g/L。

B液：9K營養鹽液350 mL，調pH=1.8，添加硫氰酸鉀6 g/L。

C液：硫酸亞鐵10 g，加入 50 mL 9K（pH=1.8）營養鹽液，0.22 μm濾膜過濾除菌。

A、B液121 ℃滅菌20 min，冷卻至80 ℃左右，A、B、C液紗布過濾混合均化，倒制平板（9 cm)，每板大約25 mL。

（2）利用該培養基，結合水盤培養法及微生物分離純化技術，通過培養獲得高溫嗜熱浸礦菌、中等嗜熱浸礦菌以及嗜中溫浸礦菌的固體平板單一菌落，通過反復分離最終獲得浸礦菌純培養。掃描電鏡及實際菌落形態照片表明：浸礦菌在固體平板表面形成圓形粘液狀米黃色菌落，菌落內部結合較為松散，菌落直徑可達2 mm左右，單個細菌通過胞外附屬結構或物質與培養基基質緊密相連。

［1］鄧敬石. 高溫嗜熱菌浸出硫化礦的研究現狀及展望[J]. 云南冶金, 2005, 34(1): 21-25.

［2］周吉奎. 三類生物冶金微生物菌種的選育及其與礦物作用研究[D].長沙：中南大學(博士學位論文), 2004.

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［5］丁建南, 王淀佐, 邱冠周. 幾種高溫浸礦菌的分離鑒定及其應用基礎與浸礦潛力研究［D］. 長沙：中南大學(博士學位論文), 2007.

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［7］ 劉露, 張勇, 李銘, 吳東平, 李想. 氧化亞鐵硫桿菌培養的“瓶頸”問題研究與突破[J]. 潔凈煤技術, 2007, 13(5): 27-30.

［8］ 劉德洪. 氧化亞鐵硫桿菌在固體培養基上的最佳生長行為[J]. 鄂州大學學報, 2007（5）: 60-63.

［9］ 夏金蘭, 邱冠周, 鞏三強, 潘佳民, 等. 極端嗜酸熱古菌分離純化固體培養基及配制方法: 中國, 20110095165.8. 2011［P］.

Application Potential of a New-type Coagulator for Purifying Bioleaching Microorganisms by the Solid Plate Method

XIA Jin-Lan1,2，PAN Jia-Min1， GONG San-Qiang1，JIN Xue-Jie1，NIE Zhen-Yuan1，YAN Yi-Ying1，QIU Guan-Zhou1,2
（1. Central South University, Hu’nan Changsha 410083, China；2. Key Laboratory of Biometallurgy of Ministry of Education, Hu’nan Changsha 410083, China）

A kind of solid plate culture medium for purifying bioleaching microorganisms was designed by using a new high temperature resistance and acid resistance coagulator. Combined with the water-dish culture method,solid plate culture and purifying of thermophilic bioleaching bacteria(Acidianus manzaensis), midthermophilic bioleaching bacteria(Ferroplasma thermophilum L1) ,mesophilic bioleaching bacteria (from the natural acid mine drainage) were realized. The scanning electron microscope revealed that the colony inner was incompact, bacteria in the colony tightly adhered to stroma of the solid plate by extracellular appendages. These results indicate that the new solid plate will have great potential for screening, identification, genetic engineering of leaching bacteria.

Coagulator； Solid culture medium； Bioleaching bacteria； Scanning electron microscope

TQ 314

A

1671-0460（2012）06-0624-06

2012-03-10

夏金蘭（1964-），男，湖南株洲人，教授，博士學位，1988年畢業于武漢大學分析化學專業，研究方向是極端環境微生物及其應用基礎。E-mail：jlxia@mail.csu.edu.cn。

潘佳民（1983-），男，碩士，研究方向:微生物學。E-mail：panjia_9@163.com。