酶解蠶豆蛋白制備多肽酒及其抗氧化性研究

楊希娟 黨 斌 劉玉皎 耿貴工

(青海省農林科學院1，西寧 810016)

(青藏高原農產品加工重點實驗室2，西寧 810016)

蠶豆，別名胡豆、南豆、羅漢豆，是一種蛋白質含量豐富的豆科植物。蠶豆產量在全世界食用豆類中位居第6，在中國其播種面積和產量是除大豆和花生之外種植面積和產量最多的食用豆類作物［1］。蠶豆中的蛋白質質量分數達25% ～35%，蠶豆蛋白的氨基酸組成接近人體和動物所需要的理想比例，其中賴氨酸質量分數比谷類高出3倍，所以蠶豆被譽為植物蛋白質的新來源［2－4］。目前蠶豆在我國主要用作蔬菜和飼料，我國食品加工業主要利用蠶豆生產粉絲，而作為重要營養成分的蛋白質未被合理利用。

蛋白質在酶解過程中可獲得許多功能性多肽，這些多肽具有抗高血壓、降膽固醇、抗氧化、改善元素吸收、礦物質運輸、促進生長等功能，在食品工業中應用廣泛［5］。其中將多肽進行發酵加工制作多肽飲料及多肽酒是多肽重要的應用途徑。目前已有關于乳清多肽酒［6］和豆乳酒［7］的研制開發。目前利用蠶豆蛋白為原料制備蠶豆多肽酒還未見報道。本試驗利用蛋白酶酶解蠶豆蛋白制備多肽酒，并對其抗氧化性進行研究，以期為蠶豆蛋白的綜合利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

蠶豆原料:青海省農林科學院;葡萄酒用高活性干酵母:安琪酵母股份有限公司;堿性蛋白酶:北京奧博星生物技術有限責任公司，活性≥200 000 U/g，生化試劑;二苯代苦味?；杂苫?DPPH·):Sigma公司;偏重亞硫酸鉀(二氧化硫含量為50%)、鐵氰化鉀、硫酸亞鐵、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、三氯乙酸、鄰苯三酚、水楊酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、無水乙醇、鹽酸等均為國產分析純;蔗糖為市售食品級。

S－263凱氏定氮儀:瑞典FOSS公司;SP－1500型實驗型噴霧干燥機:上海順儀實驗有限公司;TGL－20M高速臺式冷凍離心機:湘儀離心機儀器有限公司;雷磁PHS－25型pH計:上海雷磁儀器廠;HHS－6S電子恒溫不銹鋼水浴鍋:上海光地儀器設備有限公司;AL204電子天平:梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司;FW－80高速萬能粉碎機:北京德威特儀器有限公司;DHP－9272電熱恒溫培養箱:蘇州江東精密儀器有限公司;UV－1801紫外－可見分光光度計:北京北分瑞麗分析儀器(集團)公司。

1.2 試驗設計與方法

1.2.1 蠶豆蛋白的制備工藝流程［8］

蠶豆→脫皮→粉碎(過80目篩)→調至pH堿性→加熱攪拌1 h→4 000 r/min離心20 min→過濾→濾液調pH酸性并攪拌→4 000 r/min離心20 min→沉淀層水洗至中性→噴霧干燥

1.2.2 蠶豆多肽酒制備［9］

1.2.2.1 工藝流程

蠶豆蛋白→酶解→滅酶→離心→酶解液→調配→接種活化酵母→發酵→終止發酵→離心或抽濾→配制→過濾→裝瓶→滅菌→冷卻后封口保存

1.2.2.2 操作要點

酶解:將蠶豆蛋白加水配成32 g/L的溶液，然后調節至pH 9.0，加入10 000 U/g堿性蛋白酶，45℃進行酶解2 h，在酶解過程中，要保持酶解液溫度恒定，并用0.1 mol/L的氫氧化鈉維持pH不變。

滅酶、離心:酶解完成后加熱煮沸5 min滅酶，然后3 000 r/min離心15 min，得到酶解上清液。

調配:酶解液先加入100 mg/L SO2，再加入占酶解液體積22%的蔗糖，攪拌溶解，于37℃的水浴中預熱。

活化酵母:將安琪葡萄酒用活性干酵母加入蠶豆多肽液中，在35～40℃的培養箱里培養0.5 h，按一定的接種量接種酵母。

發酵:將活化后的酵母接種到發酵液中發酵，在一定的發酵溫度發酵一定時間，至可溶性固形物不再下降停止發酵，發酵結束后酒精度達到10左右。

滅菌:在70℃條件下滅菌15 min，冷卻至室溫后封口保存。

1.2.3 蠶豆蛋白酶解優化試驗

以影響蠶豆蛋白水解度的底物濃度、溫度、酶用量及pH為4個試驗因子，以蠶豆蛋白的水解度(DH)為目標，進行中心組合試驗設計(表1)。通過Design Expert 8.0.5軟件對試驗數據進行回歸分析，用以確定蠶豆蛋白酶解的最佳工藝條件。

表1 中心組合設計因素與水平

1.2.4 蠶豆多肽酒發酵試驗

1.2.4.1 蠶豆多肽酒發酵的單因素試驗

分別考察加糖量、酵母用量、發酵溫度、發酵時間對蠶豆多肽酒酒精含量的影響，確定蠶豆多肽酒發酵的適宜條件。各因素的試驗范圍為加糖量:14%、16%、18%、20%、22%;酵母用量:0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%;發酵溫度:19、22、25、28、31 ℃;發酵時間:3、4、5、6、7、8、9 d。試驗重復3次，取平均值。

1.2.4.2 蠶豆多肽酒發酵條件優化

在單因素的基礎上，以加糖量、酵母接種量、發酵溫度為因素，以酒精含量為指標，采用四因素三水平L9(34)的正交試驗(表2)進行優化選擇，試驗重復3次，取平均值。

表2 蠶豆多肽酒發酵正交試驗設計

1.3 測定指標與方法

1.3.1 酒精度的測定

采用酒精計法［10］。

1.3.2 蠶豆蛋白基本營養成分測定

蛋白含量測定:凱氏定氮法GB 5009.5—1985;淀粉測定:菲林試劑滴定法GB 5006—1985;粗纖維測定:酸堿處理法GB 5009.10—1985;粗灰分測定:550℃灼燒法GB 5009.4—1985;水分測定:直接干燥法 GB 5009.3—1985。

1.3.3 水解度的測定［11］

水解度(DH)=N1/N2×100%

式中:N1為水解后生成的NH2基的量/g/100 mL;N2為樣品總氮含量/g/100 mL。

水解后生成的NH2基的量由氨基氮的測定法即雙指示劑甲醛滴定法測得，樣品總含氮量由微量凱氏定氮法測定。

1.3.4 DPPH·清除能力測定［12－13］

取一定濃度的樣品溶液4 mL加入1 mL用無水乙醇配制的DPPH·溶液，并使DPPH·終濃度為0.1 mmol/L。用力振搖混勻后置暗室中靜置30 min，于517 nm波長處測定吸光度。按下式計算DPPH·清除率。

DPPH·清除率=［1－(Ax－Ax0)/A0)］×100%

式中:Ax為加入樣品溶液和DPPH·后的吸光度;Ax0為樣品溶液本底的吸光度;A0為DPPH·和蒸餾水的吸光度。

1.3.5 氧自由基清除率測定［14－15］

采用鄰苯三酚自氧化法測定。取50 mmol/L Tris－HCl緩沖液(pH 8.2)4.5 mL，置于 25 ℃水浴中保溫20 min，分別加入1 mL樣品溶液和0.4 mL 25 mmol/L鄰苯三酚溶液，混勻后于25℃水浴中反應5 min，加入1 mL 8 mmol/L HCl終止反應，于299 nm處測定吸光度(Ax)，空白對照組以相同體積蒸餾水代替樣品。每個試樣做3個平行樣，取平均值，按下式計算O2－·清除率:

O2－·清除率 =(A0－Ax)/A0×100%

式中:A0為空白對照液吸光度，Ax為樣品溶液吸光度。

1.3.6 羥自由基清除率測定［16－17］

在試管中加入0.5 mL 10 mmol/L水楊酸－乙醇溶液，0.5 mL 樣品溶液 0.5 mL 10 mmol/L FeSO4溶液，3.5 mL蒸餾水，最后加入5 mL 100 mmol/L H2O2啟動Fenton反應，搖勻后于510 nm處測定吸光度A1;取0.5 mL的蒸餾水代替10 mmol/L FeSO4溶液所測得的吸光度為A2;取0.5 mL的蒸餾水代替酶解液所測得的吸光度為A3。羥自由基清除率表示為:

·OH 清除率=［1－(A1－A2)/A3］×100%

2 結果與分析

2.1 蠶豆蛋白基本組成成分分析

本試驗制備的蠶豆蛋白粉中蛋白質含量為82.6%(表3)，此外還含有部分的淀粉和纖維物質。在蛋白酶解過程中底物濃度以凈蛋白含量計算。

表3 蠶豆蛋白主要組成成分/%

2.2 蠶豆蛋白酶解試驗

2.2.1 回歸模型的建立及顯著性檢驗

采用4因素中心組合試驗設計對蠶豆蛋白酶解的工藝進行優化，試驗方案及結果見表4。以蠶豆蛋白的水解度Y為響應面，底物濃度(X1)，酶解溫度(X2)，酶用量(X3)，pH(X4)為自變量，采用 Design expert 8.0.5軟件對表4中的數據進行二次多元回歸擬合，得到堿性蛋白酶酶解蠶豆蛋白的數學模型為(已剔除不顯著項):

回歸方程經方差分析后進行顯著性及擬合度檢驗。由表5可知，回歸方程P=0.000 1＜0.01，達到極顯著水平，失擬項檢驗P=0.139 4＞0.01，復相關系數R2=0.988 1，S/N(信噪比)為 31.187 遠大于 4，表明該數學模型中4個因素對酶解蠶豆蛋白水解度的影響達98.81%，而其他因素的影響和誤差占1.19%，即只有1.19%的變異不能由該模型解釋，預測值和實測值有高度的相關性。該回歸方程可較好地描述各因素與響應值之間的真實關系，可利用該回歸方程確定最佳酶解工藝條件。

各個因素與蠶豆蛋白水解度的顯著性分析結果(表5)表明，底物濃度(X1)、酶解溫度(X2)、pH(X4)對水解度的影響達到極顯著水平，即底物濃度、酶解溫度和pH對水解度有極顯著的影響;4個因素的二次項均極顯著，表明4個因素對蠶豆蛋白水解度的影響不是簡單的線性關系，存在明顯的二次關系;底物濃度(X1)與加酶量(X3)，底物濃度(X1)與pH(X4)、酶解溫度(X2)與pH(X4)的交互項回歸系數極顯著，即表明它們之間存在明顯的交互作用。

表4 中心組合設計試驗結果

表5 回歸模型的方差分析表

2.2.2 蠶豆蛋白酶解的優化工藝條件

在試驗結果分析及模型擬合的基礎上，利用Design expert 8.0.5軟件進一步優化試驗參數，即為獲得最大水解度情況下，優化得到堿性蛋白酶酶解蠶豆蛋白的適宜工藝參數為 X1=0.12、X2= －0.61、X3=－0.089、X4=1.00，Y=19.741 1%。即當底物濃度為32 U/g，水解溫度為43.17 ℃，酶用量為9 821.12 U/g，pH 9.50的條件下酶解2 h，蠶豆蛋白的水解度理論最大值為19.741 1%。在優化的工藝參數條件下酶解蠶豆蛋白，實際測得蠶豆蛋白水解度為19.64%，與預測值基本符合。

2.3 蠶豆多肽酒發酵工藝條件

2.3.1 加糖量對發酵酒酒精含量的影響

圖1 加糖量對蠶豆多肽酒發酵酒酒精含量的影響

由圖1可知，隨著加糖量的增加，蠶豆多肽酒酒精含量不斷增加，但增加的趨勢趨于平緩。加糖量低，發酵不完全，酒精生成量較緩，發酵酒的最終酒精度低。隨著加糖量的增多，發酵酒精度升高。但當加糖量達到20%以上時，發酵的酒精含量基本不在增加，加糖量應選擇20%～22%。

2.3.2 酵母接種量對發酵酒酒精含量的影響

由圖2可知，隨著酵母接種量的增加，蠶豆多肽酒的酒精含量先升高后降低。接種酵母量少，發酵不充分，產生酒精的速度緩慢且發酵酒的最終酒度低。隨著接種酵母量的加大，發酵速度加快，生成較多的酒精。但當酵母接種量達到0.2%以上時，發酵酒的酒精含量基本穩定，說明接種量過大會導致酵母早衰，同時會出現菌體自溶現象，并會產生苦味和酵母臭味，從而影響產品的品質。綜合考慮產品的風味、酒精度和經濟性，活性干酵母接種量選擇0.2%。

圖2 酵母接種量對蠶豆多肽酒發酵酒酒精含量的影響

2.3.3 發酵溫度對發酵酒酒精含量的影響

圖3可知，隨著發酵溫度的升高，發酵酒的酒精含量呈現先增加后升高的趨勢。發酵溫度較低時，酵母發酵速度較慢，發酵酒的酒度低。隨著發酵溫度的升高，酵母生長速度加快，能較充分利用營養物質產生酒精，使得發酵酒酒度較高。當發酵溫度達到28℃時，發酵溫度過高，酵母發酵速度過快，不利于發酵酒風味的形成，口感較差，而且高溫發酵容易引起酵母早衰，發酵能力減弱，糖分不能得到充分利用，在發酵后期容易出現酸敗。因此要獲得較高酒精度的蠶豆多肽酒，就必須把發酵溫度控制在適當的水平，既要保證較高的發酵速度，又要獲得較高的酒精度。所以發酵溫度選擇25℃。

圖3 發酵溫度對蠶豆多肽酒發酵酒酒精含量的影響

2.3.4 發酵時間對發酵酒酒精含量的影響

由圖4可知，蠶豆多肽酒的酒精含量隨著發酵時間的延長出現不斷增加的趨勢，發酵前6 d酒精含量增加顯著，發酵6 d以后，發酵酒酒精趨于穩定，發酵接近終點，因此發酵時間選擇6 d。

圖4 發酵時間對蠶豆多肽酒發酵酒酒精含量的影響

2.3.5 蠶豆多肽酒發酵的正交試驗結果

由表6可知，各因素對多肽酒發酵酒精度的影響順序為C＞B＞A。即發酵溫度對蠶豆多肽酒酒精含量的影響最大，其次是酵母接種量，最后是加糖量。極差分析的最優組合為A1B3C3。即加糖量20%、酵母添加量0.22%、發酵溫度28℃。在此條件下制得的蠶豆多肽酒的酒精含量為9.6%，呈棕黃色，口感醇正、鮮爽、無澀味、略有苦味，具有發酵酒的醇香。

表6 蠶豆多肽酒正交試驗結果與分析

2.4 蠶豆多肽酒發酵過程中抗氧化性變化

從圖5可以看出，隨著發酵的進行，蠶豆多肽酒的·OH清除率和DPPH·清除率均出現先降低后升高的趨勢。發酵3 d時·OH清除率和DPPH·清除率均達到最低點。當發酵至4 d時，·OH清除率和DPPH·清除率又隨發酵的進行而增加，當發酵至5 d以后·OH清除率和DPPH·清除率增加的趨勢變緩，基本趨于穩定，比發酵前有所增加。這是由于酵母菌生長繁殖需要營養，因此在最初的發酵過程中酵母消耗了發酵液中的部分多肽，使其發酵酒的·OH清除率和DPPH·清除率有所降低，隨發酵時間的延長，酵母菌發酵產生蛋白酶進而酶解蛋白質生成氨基酸和多肽，從而增加了發酵液中多肽含量，使發酵酒的·OH清除率和DPPH·清除率有所升高。

圖5 蠶豆多肽酒發酵過程中抗氧化性變化

在發酵前4 d，隨著發酵時間的延長，蠶豆多肽酒的O2－·清除率逐漸下降，當發酵至4 d以后，O2－·清除率下降的趨勢逐漸趨于平緩，發酵至7 d時O2－·清除率由發酵前的62.43%下降至45.98%。原因有待進一步研究。

3 結論

3.1 采用堿性蛋白酶酶解蠶豆蛋白的最佳工藝條件為:底物濃度32 U/g，水解溫度43.17℃，酶用量9 821.12 U/g，pH 9.50，在此條件下酶解2 h，蠶豆蛋白的水解度達到19.64%。

3.2 確定蠶豆多肽酒發酵的適宜條件為:加糖量20%、酵母添加量0.22%、發酵溫度28℃，發酵時間6 d，在此條件下制得的蠶豆多肽酒的酒精含量為9.6%，呈透明的棕黃色，口感醇正、鮮爽、略有苦味，具有發酵酒的醇香。

3.3 蠶豆多肽酒具有較強的抗氧化性。蠶豆多肽酒的·OH清除率和DPPH·清除率較發酵前有所提高，O2－·清除率比發酵前有所降低。

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