超聲波輔助提取扁核木葉蛋白的工藝優化

梁麗琴 魏學智 段江燕 張曉俊 安 娜

(山西師范大學生命科學學院，臨汾 041004)

蛋白質是供給必需的氨基酸以維持生理健康的重要物質，隨著食品工業的快速發展及生活水平的提高，全球蛋白質資源緊缺現象日益嚴重。動物蛋白生產成本較高，且含有膽固醇，不適于高血壓及心臟病等病人。植物蛋白營養豐富，必需氨基酸組成與比例均優于動物蛋白，尤其是它不含膽固醇，因而深受食品科學家的青睞。近年來，農產品價格不斷上漲，其中豆類產品價格的上漲使得種子蛋白的生產加工成本也逐漸提高。而植物葉蛋白資源豐富，其必需氨基酸的數量和比例均優于大豆餅蛋白［1］，因而開發植物葉蛋白具有重要意義。

扁核木(Prinsepia uniflora Batal)為薔薇科扁核木屬的落葉灌木，在山西、陜西、內蒙古、東北等地均有分布。扁核木枝繁葉茂，果實可以食用，種子可以榨油也可以入藥，因而在生產、生態和造景觀賞方面均有很好的開發應用前景［2］。目前，有關扁核木的開發研究主要集中在育種栽培方面，而關于扁核木的果實及葉的開發研究未見報道。因而，本試驗將對扁核木葉蛋白的提取方法進行研究。傳統的酸加熱法提取葉蛋白效率低，純度低，且耗時。酶法雖然可以提高效率，但酶價格昂貴，易失活，提取過程也較難控制。超聲波能夠產生增溶作用［3］，提取效率高，提取時間短，且其成本低、設備簡單、操作容易，現已被用于大豆蛋白［4－6］、玉米醇溶蛋白［7］、蕎麥蛋白［8］、棉籽蛋白［9］、小麥胚芽蛋白［10］及花生蛋白［11］等的輔助提取，因此，本試驗將探討超聲波輔助酸加熱法提取扁核木葉蛋白，以期為扁核木葉蛋白的食品開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

扁核木葉:采自山西臨汾龍寺鎮;所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

pHS－3C酸度計、HJ－6A數顯多頭磁力恒溫攪拌器:金壇市榮華儀器制造有限公司;HAP－300超聲波處理儀:寧波新芝生物科技股份有限公司;LG－24A型高速離心機:北京醫用離心機廠;LG10－2.4A型高速冷凍離心機:上海安亭科學儀器廠;數顯恒溫水浴鍋:常州國華電器有限公司;UV－7504c紫外可見分光光度計:上海欣茂儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 扁核木葉的處理

取新鮮的無病蟲害扁核木葉，放于潔凈的培養皿中，用自來水沖洗3次后，再用蒸餾水洗3次，用濾紙吸去多余水分。

1.3.2 標準曲線的繪制

準確稱取10 g扁核木葉，將其剪成0.5 cm長的小段，加石英砂充分研磨后，加入50 mL pH 3.6的磷酸鹽緩沖液中，攪拌均勻后于40℃下超聲波提取30 min，然后在4 000 r/min離心20 min，取上清液并測定體積，取部分上清液進行半微量凱氏定氮法測定其蛋白質含量，剩余上清液用于制作標準曲線。用考馬斯亮藍法在595 nm波長下測定提取液的吸光度Y［12］。以提取液蛋白質含量為橫坐標X，吸光度Y為縱坐標繪制標準曲線，最小二乘法擬合得方程:

1.3.3 扁核木葉蛋白的酸加熱提取及超聲波輔助提取方法

準確稱取2 g新鮮的扁核木葉，將其剪成0.5 cm長的小段，加石英砂充分研磨，按一定液料比加入一定溫度下預熱的pH磷酸鹽緩沖液，在一定溫度下攪拌一定時間(超聲波處理，功率為50 W)，4 000 r/min離心15 min，再將離心液用快速濾紙過濾除去漂浮物，定容至30 mL，用考馬斯亮藍法595 nm波長下測定濾液的吸光值，并計算扁核木葉蛋白含量［13］。

1.3.4 扁核木葉蛋白提取率計算［8］

1.3.5 扁核木葉基本化學成分測定［14］

蛋白質含量測定:凱氏定氮法測定。粗脂肪含量測定:索氏抽提法。水分測定:常壓烘干法。

1.4 數據處理

采用Excel軟件對單因素試驗結果進行數據處理，正交試驗結果采用極差分析。

2 結果與分析

2.1 扁核木葉基本化學成分

由表1可知，扁核木葉蛋白占葉片鮮重的5.36%。據資料報道［15］，葉蛋白主要包括溶解性好的細胞質蛋白和葉綠體內基質蛋白、線粒體蛋白、難溶的葉綠體結構蛋白、線粒體結構蛋白、核蛋白及細胞壁蛋白、另外還有脫氫酶過氧化物酶及多酚氧化酶等多種酶組成的蛋白質混合體。其中，核酮糖－1，5－二磷酸羧化酶占細胞質蛋白質的70%～80%。

表1 扁核木葉基本化學成分/%

2.2 處理時間對扁核木葉蛋白提取率的影響

設定液料比1∶10，pH 3.6，溫度40 ℃為不變因素，處理時間分別為 10、20、30、40、50 min，時間對扁核木葉蛋白提取率的影響如圖1。

由圖1可知，處理時間在10～50 min之內，用超聲波輔助酸溶法提取扁核木葉蛋白，其提取率均遠高于傳統的酸溶法。在處理時間為10～20 min之間，用超聲波輔助法提取時，隨著時間的延長，扁核木葉蛋白的提取率與時間呈正相關，超過20 min后，提取率增加不再明顯，且逐漸趨于穩定。這可能是由于在10～20 min之內，隨著時間的延長，形成的氣泡逐漸增多，高頻振蕩逐漸劇烈，吸收的聲能逐漸增大，破壁的效果逐漸增強，蛋白質溶出也逐漸增多。而超過20 min后，隨著時間的延長，提取率反而不斷下降，這可能是由于超聲波的強烈振動及熱效應作用導致蛋白變性，從而使葉蛋白水溶性變差。

圖1 處理時間對扁核木葉蛋白提取率的影響

2.3 溫度對扁核木葉蛋白提取率的影響

設定液料比1∶10，pH 3.6，處理時間30 min 為不變因素，溫度分別為30、35、40、45、50 ℃，溫度對扁核木葉蛋白提取率的影響如圖2。

圖2 溫度對扁核木葉蛋白提取率的影響

由圖2可知，在30～45℃之間，隨著溫度的升高，扁核木葉蛋白的提取率也逐漸增加，當溫度為45℃時，無論是傳統的酸加熱法還是加以超聲波輔助，葉蛋白的提取率均最高，此時，用超聲波輔助酸溶法提取葉蛋白的提取率可達85.72%。當溫度超過45℃時，葉蛋白提取率開始下降，這可能是由于此時蛋白質開始變性，蛋白質分子展開導致疏水基團的暴露及蛋白質分子相互纏繞，從而使溶解度降低。整體看來，不同溫度下，用超聲波輔助酸加熱法提取扁核木葉蛋白的提取率也均高于傳統的酸加熱法的提取率。

2.4 液料比對扁核木葉蛋白提取率的影響

設定pH 3.6，溫度40℃，處理時間30 min為不變因素，液料比分別為 6、8、10、12、14，液料比對扁核木葉蛋白提取率的影響如圖3。

圖3 液料比對扁核木葉蛋白提取率的影響

由圖3可知，在液料比為6～14之間時，隨著液料比的增加，提取率逐漸增高，當液料比為12時，扁核木葉蛋白的提取率達到最高，當液料比超過12時，葉蛋白的提取率趨于穩定，說明此時蛋白質已被最大程度的溶解出來。整體看來，在不同液料比下，用超聲波輔助酸加熱法提取扁核木葉蛋白的提取率也均遠高于傳統的酸加熱法的提取率。

2.5 pH對扁核木葉蛋白提取率的影響

設定液料比1∶10，溫度40℃，處理時間30 min為不變因素，pH 分別為 3.0、3.6、4.2、4.8、5.4，pH對扁核木葉蛋白提取率的影響如圖4。

圖4 pH對扁核木葉蛋白提取率的影響

由圖4可知，在pH 3.0～5.4之間，扁核木葉蛋白的提取率與pH呈負相關，在pH為3.0時扁核木葉蛋白提取率最高。當提取液pH逐漸增大時，扁核木葉蛋白的提取率也逐漸下降。這是由于蛋白質是一種兩性電解質，當溶液pH小于蛋白質的等電點時，酸性溶液中大量的氫離子使蛋白質氫離子化而帶有大量正電荷，這些帶有正電荷的基團會與周圍溶液中的水分子發生結合，在蛋白質周圍形成一層水化層，從而使得蛋白質更穩定的存在于溶液中，即增加了蛋白質的溶解度。在pH 3.0～5.4酸性范圍內，扁核木葉中的蛋白質帶有正電荷，且隨著pH的逐漸增大，葉蛋白質所帶正電荷逐漸減少，蛋白質的溶解度也逐漸降低。整體看來，在pH 3.0～5.4之間，用超聲波輔助酸溶法提取扁核木葉蛋白的提取率也均遠高于傳統的酸加熱法的提取率。

2.6 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以節約生產成本為原則，對溫度、時間、pH、液料比4個因素各取3個水平進行正交試驗，以扁核木葉蛋白的提取率為指標，探索酸加熱法及超聲波輔助酸加熱法提取扁核木葉蛋白的最佳提取條件。正交試驗因素－水平設計見表2，正交試驗結果與極差分析見表3。

通過表3極差分析結果可知，酸溶法提取扁核木葉蛋白的最佳工藝為A3B3C1D2，即時間25 min、溫度45℃、液料比8、pH 3.6，各因素對扁核木葉蛋白提取率影響的顯著次序為A＞C＞D＞B，即時間＞液料比＞pH＞溫度;超聲波輔助酸加熱法提取扁核木葉蛋白的最佳工藝為B＞C＞D＞A，即時間20 min、溫度40℃、液料比12、pH4.2，各因素對扁核木葉蛋白提取率影響大小的次序為B＞C＞D＞A，即:溫度＞液料比＞pH＞時間。

2.7 驗證試驗

利用上述最佳工藝條件分別進行驗證試驗，實測得用酸加熱法提取扁核木葉蛋白，其提取率為70.37%，用超聲波輔助酸加熱法提取扁核木葉蛋白，其提取率為87.90%，超聲波輔助酸加熱法較傳統的酸加熱法提取扁核木葉蛋白的提取率提高了17.53%。

2.8 酸沉淀扁核木葉蛋白

用0.1 mol/L的HCl調節扁核木葉蛋白超聲波提取液至 pH 5.4，4 000 r/min 離心 15 min，脂肪、葉綠素、糖類及有機物等雜質留于上清液中，去上清液，沉淀則為純化的扁核木葉蛋白。

表3 正交試驗結果與極差分析

3 結論

3.1 采用酸加熱法提取扁核木葉蛋白的最佳工藝條件:時間 25 min、溫度 45 ℃、液料比 8、pH 3.6，此時，扁核木葉蛋白的提取率為70.37%。

3.2 采用超聲波輔助酸加熱法提取扁核木葉蛋白的最佳工藝條件:時間20 min、溫度40℃、液料比12、pH 4.2，此時，扁核木葉蛋白的提取率為87.9%。

3.3 相對于傳統的酸溶法，用超聲波輔助酸溶法提取扁核木葉蛋白，節省了時間，降低了溫度，并增大了pH，這大大降低了生產成本。

3.4 采用超聲波輔助酸溶法提取可以提高扁核木葉蛋白的提取率，與單純酸溶法提取法相比，扁核木葉蛋白提取率提高了17.53%。

3.5 將扁核木葉蛋白超聲波提取液調至pH 5.4，對扁核木葉蛋白進行酸沉淀，可將扁核木葉蛋白從提取液中分離出來。

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