巨大革耳遺傳多樣性的ISSR分析*

江玉姬，謝寶貴，劉新銳，鄧優錦，陳東興，朱 堅

（1.福建農林大學食品科學學院，福建 福州 350002；2.福建農林大學菌物研究中心，福建 福州 350002；3.福建農林大學園藝學院，福建 福州 350002）

巨大革耳（Panus giganteus） 又名大杯傘、大杯蕈、大漏斗菌、豬肚菇、筍菇、大杯香菇等，隸屬真擔子菌門（Basidiomycota）、擔子菌綱 （Basidiomycetes）、多孔菌目（Polyporales）、多孔菌科（Polyporaceae）、革耳屬 （Panus）[1]。自然環境中夏、秋季節大量群生或叢生于林地腐枝層上，主要分布在我國的河北、山西、黑龍江、青海等地區。從自然界的生長習性和分布可以看出，巨大革耳（豬肚菇）是一種中高溫型的美味珍稀食用菌種類，菌肉肥厚，個體較大，味道鮮美，是一種很有發展前途的夏、秋季栽培食用菌[2]。人工栽培多進行熟料袋栽，栽培方法與常規木腐生菌相同。但巨大革耳（豬肚菇）人工栽培歷史很短，目前栽培用種主要來源于野生資源的馴化和引種，存在著同種異名，同名異種的現象，給生產和育種帶來了混亂產生了嚴重的后果。本文應用ISSR分子標記對國內不同地區收集或分離的9株巨大革耳進行了分子遺傳多樣性研究，為巨大革耳菌種管理、遺傳資源的保護和充分利用、育種研究工作的開展等提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試菌種

9株供試菌株，由福建食用菌株，質資源保藏管理中心提供，試驗編號及其它信息如表1所示。

1.1.2 試劑

20個ISSR引物為上海Sangon生物工程公司生產；PCR kit、500 bp DNA Ladder Marker購自 TaKaRa公司，其它試劑均為國產分析純。

1.1.3 供試培養基

斜面固體培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，水1 000 mL，pH值自然。

液體培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g，水1 000mL，pH值自然。

表1 供試巨大革耳菌株及來源

出菇培養基：棉籽殼85%、麥麩10%、玉米粉3%、碳酸鈣或石膏2%，含水量65%～70%，pH6.0。

1.1.4 巨大革耳菌絲體制備

供試菌株在PDA試管斜面培養基上培養7 d～10 d后，轉接到新鮮PDA試管斜面培養基上培養至滿管，用接種耙耙碎菌塊，接入250 mL三角瓶液體培養基中，每個菌株各接2瓶，置于120 r·min-1搖床上26℃恒溫培養10 d，用紗布過濾，蒸餾水沖洗干凈，濾紙吸干水分，稱取1 g菌絲用濾紙包好，保存于-20℃下備用。

1.1.5 DNA提取

取1 g菌絲放入研缽，加入液氮迅速研磨成粉末，轉入7 mL的離心管，采用CTAB法提取DNA，-20℃保存備用，具體操作參考文獻[3]、[4]。

1.1.6 ISSR擴增

ISSR 反應體系 25 μL：模板 DNA 1.2 ng·μL-1，引物0.4 μmol·L-1，dNTPs 0.2 mmol·L-1，MgCl22 mmol·L-1，Taq DNA聚合酶2 U，PCR緩沖液1×，具體操作參考文獻[3]、 [4]，將重復性好、強度較高、清晰可辨無爭議、能體現菌株間差異的條帶確認為標記條帶，進行相應的統計和分析。

1.1.7 數據統計與分析

ISSR擴增產物以0、1統計建立ISSR數據庫。將相同引物PCR擴增產物中電泳遷移率一致的標記條帶確認為同一條帶，擴增陽性記錄為“1”，擴增陰性記錄為“0”，利用SPSS10.0分析軟件的Jaccard方法計算樣品間的遺傳相似性，用類平均法（UPGMA） 對ISSR統計形成“0/1”表型數據矩陣進行聚類分析，生成遺傳距離聚類圖[5,6]。

1.1.8 出菇實驗

栽培出菇實驗參考劉斌等[7]的方法。

2 結果與分析

2.1 ISSR結果與分析

從20個引物篩選出4個多態性好的引物（表2），擴增的結果見圖1。

表2 ISSR引物序列

圖1-1 引物ISSR5和ISSR12對巨大革耳菌株ISSR-PCR擴增圖譜

圖1-2引物ISSR13和ISSR15的擴增電泳圖

從圖1中可知，4個引物對9個菌株擴增的片段大小在1.0 kb～3.0 kb之間，各個引物擴增的位點數分別為7、8、5、7，平均位點數為6.25；平均每個引物產生個5.75個多態性條帶。ISSR共擴增出27個位點，多態性條帶總共為23，多態率為85.19%。經過軟件處理后，建立樹狀圖 （圖 2）。

圖2 9個菌株的ISSR聚類樹狀圖

從圖2可以看出，5號、6號、7號、9號菌株聚為一類，它們的相異系數為0，可能為同種異名；3號、4號菌株及1號、8號菌株各聚為一類，2號菌株單獨一類；2號菌株與其它8個菌株的遺傳距離很遠，3號、4號、1號、8號菌株與5號、6號、7號、9號菌株有一定的遺傳距離。當相異系數D為0.20水平上，9個菌株聚為2類：Ι類包括2號菌株；Π類包括1號、3號、4號、5號、6號、7號、8號、9號菌株。2號菌株與其它8個菌株的遺傳距離很遠，故對9個菌株進行了栽培出菇實驗，以觀察子實體的形態是否有差異。

2.2 子實體形態分析

根據栽培出菇實驗結果表明，C.m0002菌株的子實體（圖3）明顯不同于其它菌株，酷似多脂鱗傘（黃傘），是同名異種，單獨歸為Ι類；其它8個菌株均為巨大革耳，子實體的形態較一致，部分菌株的子實體形態見圖4、圖5和圖6，歸為第Π類。子實體特征分析的結果與ISSR分類的結果吻合。

圖3 C.m002菌株的子實體圖

圖4 C.m003菌株的子實體圖

圖5 C.m001菌株的子實體圖

圖6 C.m007菌株的子實體圖

3 討論

近年來，不斷快速發展的DNA分子標記技術越來越多的被應用在研究種質資源的多樣性以及分子輔助遺傳育種上，顯示出了極大的優越性。它不僅能快速的獲得分析結果，而且其結果不受外界環境因素和生長發育階段的影響；所以，分子標記已經成為分子水平的種質資源親緣關系及檢測種質資源多樣性和品種鑒定的有效工具[8]。

ISSR是由 Zietkiewi CZ等[9]創建的一種簡單重復序列間擴增多態性分子標記。ISSR技術與常規PCR有相同的反應條件，該技術克服了限制性內切酶片段長度多態性RFLP標記、SSR標記和隨機擴增多態性DNA標記（RAPD）的技術限制，具有操作簡單、引物擴增的結果重現性較好、模板DNA用量少等優點，且不需要知道基因組序列，可以檢測基因組許多位點的差異[6-8]，已廣泛應用于動植物種質鑒定、遺傳作圖和基因定位，尤其在分子遺傳學基礎貧乏的作物研究中顯示出極大的優勢[10,11]。但在食用菌中的應用還不多，在香菇[8]、杏鮑菇[12]、金針菇[13]、松口蘑及花鵝膏菌[11]、天麻[14]、側耳屬[10]等品種的鑒定及親緣關系研究中的應用已有報道，但用ISSR技術分析巨大革耳菌株間的親遠關系目前沒有相關的文獻報道。

9個菌株的 ISSR分析中，5號（C.m0005）、6號（C.m0006）、7號 （C.m0007）、9號 （C.m0009） 的遺傳距離為零，結合子實體的形態特征可認定它們為同種內的菌株。C.m0003、 C.m0004、 C.m0005、 C.m0006、 C.m0007、 C.m0008、C.m0009七個栽培菌株分別來自武漢、湖北嘉魚、福州、三明4個不同的地方，其中C.m0008與其它6個菌株有一定的遺傳距離，說明有一定的遺傳多態性，但不豐富。而C.m0001和C.m0002菌株與其它7個菌株間的遺傳距離較遠。出菇實驗結果表明，C.m0002菌株的子實體似多脂鱗傘（黃傘），是同名異種；其它8個菌株均為巨大革耳。本研究的結果以及ISSR標記在香菇、杏鮑菇、金針菇、側耳屬等的應用，說明ISSR分子標記在食用菌的種質資源遺傳多樣性、親緣關系分析中的應用是可信的。本研究結果也將為巨大革耳的生產和育種以及種菌管理提供基礎數據。

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