TLR3在poly（I：C）－LMW預處理后缺糖缺氧誘導的原代皮質神經元的表達意義

宋 璞 崔桂云 陳 偉 趙秋宸 花 放 沈 霞

1）徐州醫學院神經病學教研室（徐州醫學院附屬醫院神經科）徐州 221000 2）徐州醫學院臨床醫學系 徐州 221000

腦組織缺血再灌注損傷（ischemia／reperfusion，I／R）一直是人們研究的熱點，近年來，已經證實缺血部位的炎癥反應參與I／R損傷［1］。而作為自身免疫炎癥相關性蛋白重要的一員，屬于IL－1R／TIR超家族的Toll樣受體家族（Toll like receptors，TLRs），可以識別特異性配體并激活相應通路啟動免疫反應［2］。Hua等［3－4］已通過研究證實，TLR2和 TLR4可以通過調節炎性因子的水平參與I／R損傷過程。且在本實驗的前期實驗中，Wan等通過動物實驗證實，大鼠經全腦缺血再灌注后，其腦組織TLR3表達上調且存在時間依賴性。Préhaud等［5］在體外研究了人的神經元細胞對病毒感染起天然免疫反應，利用狂犬病病毒感染人類神經元系細胞NT2－N發現TLR3mRNA及IFN－βmRNA表達均上調，提示TLR通過調節炎性因子的水平參與I／R損傷過程，而且炎癥反應有可能與神經元細胞本身存在的TLR表達有關，同時，在一定條件干預下，如缺血再灌注、病毒感染等可影響其表達。poly（I：C）－LMW 為一人工合成的dsRNA片段，可特異性激活細胞上的TLR3。故本實驗以離體大鼠皮質神經元為研究對象，通過缺糖缺氧方法，在離體水平模擬缺血再灌注的病理生理過程，并通過poly（I：C）－LMW預處理等方法，檢驗神經元本身是否存在TLR3的表達，并觀察其表達在缺糖缺氧過程中的意義。

1 材料與方法

1.1實驗動物孕18dSprague－Dawley（SD）大鼠，由徐州醫學院實驗動物中心提供。

1.2主要試劑兔抗TLR3多克隆抗體（英國abcom公司），激動劑poly（I：C）－LMW（美國InvivoGen公司），neuro－basal培養基及B27（美國GIBICO公司），無糖培養基（美國GIBICO公司），RT－PCR試劑盒（北京天根生化科技有限公司），Western blot所需二抗均由徐州醫學院神經生物實驗室提供。

1.3原代皮質神經元培養及缺糖缺氧、激動劑預處理方法原代皮質神經元培養：孕18dSD大鼠，乙醚麻醉斷頭后，取胎鼠大腦皮質，剪碎，胰酶37℃消化15min，胎牛血清終止消化。加入無血清培養基（neurobasal medium 100mL含有2mL B27，200mmol／L谷氨酰胺250μL，25μmol／Lβ－巰基乙醇45.5μL）反復吹打數次，200目濾網過濾后，細胞計數，以1.2×10×5個／mL的密度接種于用多聚賴氨酸預處理的培養瓶內，置于37℃，5%CO2培養箱中培養。第4天換神經元生長培養基（neurobasal medium 100mL含有2mL B27，200mmol／L谷氨酰胺250μL），每周半換液2～3次。缺糖缺氧：取培養7d神經元細胞，換無糖培養基后，放入缺氧培養箱（37℃，5%CO2，1%O2）培養2h后，更換新鮮神經元生長培養基后，放回37℃，5%CO2培養箱中培養24h后用于實驗。激動劑預處理：取培養7d神經元細胞，更換新鮮神經元生長培養基后，加入50μL 0.1mg／mL poly（I：C）－LMW，（若使用24孔板，則每孔加5μL 0.1mg／mL poly（I：C）－LMW）使工作液濃度達1μg／mL左右，預處理12h后，用于后續操作。

1.4實驗分組將以上述方法培養7d的同批神經元細胞隨機分為4組：正常組；OGD組（缺糖缺氧）；poly（I：C）組，予1μg／mL poly（I：C）預處理12h，不缺糖缺氧；OGD＋poly（I：C）組，予1μg／mL poly（I：C）預處理12h，缺氧復氧。

1.5 Western blot檢測TLR3表達各組細胞（n＝2），加入細胞裂解液約50μL加蛋白酶抑制劑2μL，冰上孵育30 min，細胞刮刀刮離，離心。用Lowry法測定蛋白濃度。取總蛋白80μg經120g／L SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。轉印，雜交，暗室內掃描蛋白印跡條帶。

1.6 RT－PCR檢測TLR3mRNA表達

1.6.1 引物準備：根據Genebank資料，利用primer premiers5.0引物設計軟件確定最優引物，然后經Blast匹對，同時選取β－actin作為內參對照，引物由上海生工生物有限公司合成。見表1。

1.6.2 組織總RNA提?。喝‰x體培養神經元細胞，經相應預處理后，加入1mL TRNzol試劑，其后按照試劑說明書進行，提取的RNA測定D260／OD280比值，讀數1.7～1.9認為RNA純度達標。

圖1 TLR3蛋白在不同組大鼠離體皮質神經元表達情況

表1 PCR各引物序列及相關參數

1.6.3 逆轉錄：應用cDNA第一鏈合成試劑盒將提取的總RNA逆轉錄為cDNA進行PCR反應。

1.6.4 PCR擴增及結果分析：按照試劑說明書配制PCR反應體系，TLR3PCR反應條件：預變性：94℃3min；循環30次：94℃30s、56℃30s、72℃1min；終末延伸：72℃5 min。β－actin PCR反應條件：預變性：94℃3min；循環30次：94℃30s、60℃30s、72℃1min；終末延伸：72℃5min。

1.7免疫熒光各組細胞（以24孔板培養）移去培養基，PBS洗1次，4%多聚甲醛固定，PBS洗3次，0.5%Trioton－100透膜處理，PBS洗3次后封閉液封閉，0.1%tween－20洗3次后一抗孵育過夜，加二抗，0.1%tween－20后電鏡下觀察。

1.8圖像處理及統計學分析蛋白及電泳條帶均采用ImageJ軟件進行圖像分析，結果采用灰度比值表示，數據采用SPSS16.0統計分析軟件進行統計學處理，數據以均數±標準差（s）表示，2組間比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。柱狀圖采用Graph Pad Prism 5作圖軟件對于灰度值進行統計學處理后生成。

2 結果

2.1 Western blot和RT－PCR結果及分析Western blot分析顯示缺糖缺氧組TLR3蛋白表達水平明顯高于空白對照組與激動劑預處理組，激動劑預處理組TLR3蛋白表達水平比空白對照組高（P＜0.05），而缺糖缺氧組與激動劑預處理后缺糖缺氧組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。RTPCR分析顯示缺糖缺氧組TLR3蛋白表達水平明顯高于空白對照組與激動劑預處理組，激動劑預處理組TLR3蛋白表達水平比空白對照組高（P＜0.05），而缺糖缺氧組與激動劑預處理后缺糖缺氧組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1～4。

圖2 TLR3mRNA在不同組大鼠離體皮質神經元表達情況

圖3 TLR3蛋白在不同組大鼠離體皮質神經元表達的灰度比值（TLR3／β－actin）

圖4 TLR3mRNA在不同組大鼠離體皮質神經元表達的灰度比值（TLR3mRNA／β－actin）

2.2免疫熒光結果免疫熒光顯示對照組及激動劑組細胞狀態良好，呈類圓形、多邊形，周圍有較多突起，連接成蛛網狀，視野下細胞數目較多，OGD組、激動劑＋OGD組視野下細胞數目較少，且細胞形態不規則并可見較多細胞碎片，其中OGD組細胞損傷更為明顯。見圖5～9。

圖5 對照組神經元細胞免疫熒光情況

圖6 缺糖缺氧組神經元細胞免疫熒光情況

圖7 激動劑poly（I：C）－LMW預處理組神經元細胞免疫熒光情況

圖8 激動 劑 poly（I：C）－LMW預處理后缺糖缺氧組神經元細胞免疫熒光情況

圖9 各組細胞數目比值（400倍）

3 討論

近年來，缺血再灌注損傷一直是人們研究的熱點，而本實驗正是通過對離體神經元缺糖缺氧的方法，體外模擬缺血再灌注損傷的病理生理過程，從而在離體神經元細胞水平上，探究神經元本身是否存在TLR3的表達，并觀察其表達在缺氧／復氧過程中的意義。

基于人們此前的研究，雖然現已提出包括鈣超載［6］、自由基損傷［7］、NO作用［8］等數種可能機制，但具體病理生理過程仍不明確。最近幾年，研究熱點轉向了缺血區域的炎癥反應，通過研究，人們發現免疫細胞的活化與募集［9］、各種炎性因子的釋放［10－11］都可以加重組織損傷，且Toll樣受體家族成員可以被死亡細胞釋放的熱休克蛋白、纖維蛋白原及DNA和RNA片段激活［12］，這提示Toll樣受體可以參與體內的無菌性炎癥。針對于此，Hua等［3］通過研究證實TLR4在腦缺血再灌注損傷中被激活，而將TLR4基因敲除后可減輕腦損傷，這一作用可能通過調控TLR4信號通路實現。然而，在對TLR4和TLR2的對比試驗中提示兩者可能在腦缺血再灌注損傷中起到截然相反的作用，TLR2敲除小鼠在腦缺血后出現更為嚴重的癥狀，而TLR4敲除小鼠神經系統損傷程度則明顯減輕［13］。Wan等通過動物實驗也證實大鼠經全腦缺血再灌注后，其腦組織TLR3表達上調且存在時間依賴性。Préhaud等［5］利用狂犬病病毒感染人類神經元系細胞NT2－N發現TLR3mRNA及IFN－βmRNA表達均上調，基于以上研究成果，我實驗小組大膽提出了TLR通過調節炎性因子的水平參與I／R損傷過程，而且炎癥反應有可能與神經元細胞本身存在的TLR的表達有關，同時，在一定的條件干預下（如缺血再灌注、病毒感染等）可影響其表達。

TLR3可以識別病毒復制過程中產生的dsRNA而啟動抗病毒反應［14］，死亡細胞產生的mRNA也可以成為TLR3的配體［15］，而 poly（I：C）－LMW 為一人工合成的 dsRNA 片段，可特異性激活細胞上的TLR3。缺氧／復氧實驗是在離體水平模擬腦組織缺血再灌注損傷，以便更為直觀地研究某一種或幾種類型的細胞在缺血再灌注損傷中病理生理過程的改變及作用。

我們在實驗中觀察到，離體大鼠皮質神經元存在TLR3的表達，且缺氧／復氧及激動劑poly（I：C）－LMW 均可使其表達上調，并觀察到，經過poly（I：C）－LMW 預處理后的神經元行缺氧／復氧實驗，通過免疫熒光觀察到其損傷水平輕于未行預處理的缺氧／復氧組，但重于僅經預處理未行缺氧／復氧組及對照組，由此說明，poly（I：C）－LMW 預處理可使神經元細胞TLR3表達上調，并可在缺氧／復氧這一不利條件下，通過某些因素減輕細胞損傷。

再結合近年的研究進展，炎癥反應參與腦缺血／再灌注損傷機制，免疫炎癥在腦缺血／再灌注損傷中的作用已被大量研究證實，而Toll樣受體家族與免疫炎癥的緊密聯系使其獲得了人們的關注。TLR4是最早引起人們注意的家族成員，人們最先在肺臟、心臟、肝臟以及腎臟的缺血性損傷中認識到了TLR4的存在［16－19］，隨后在腦缺血／再灌注損傷中也觀察到了TLR4的活化，隨后的研究中人們認識到TLR4作為損傷因素參與I／R損傷。在體內各臟器的缺血性損傷中TLR4作為損傷因素參與其病理生理過程，Hua等［3－4］的研究將Toll樣受體家族引入了缺血性腦損傷的研究范圍，當下TLR4、TLR2、TLR9已先后被證實參與腦缺血／再灌注損傷。隨后對于TLR2的研究卻出現了與TLR4相反的現象。

而TLR3被激活后主要通過 MyD88－非依賴性通路即TRIF通路而發揮作用，最終激活干擾素調節因子3（interferon regulator factor 3，IRF3）使其磷酸化后轉位入核誘導干擾素β（interferonβ，IFN－β）基因表達［20－21］，從而使細胞出現自身免疫炎癥反應，造成細胞損傷，而根據本實驗可推斷，預先使用TLR3激動劑poly（I：C）－LMW 處理，提高了神經元細胞對缺血再灌注損傷的耐受性，且Ziegler、Hua等在早先進行的關于TLR2的實驗中亦得出了相似結果［22－23］。我們推測這可能是由于預處理組的神經元在缺氧發生前TLR3表達升高，并通過某些橫向的通路聯系反饋抑制了下游的某些損傷性因子表達，或上調了某些保護性因子的表達，從而減輕了缺氧復氧后神經元細胞自身免疫反應，進而減輕了細胞損傷。換言之，通過TLR3激動劑poly（I：C）－LMW 對原代皮質神經元預處理，提高了細胞對于缺氧環境的耐受力，從而減輕了細胞損傷。

綜上所述，原代皮質神經元細胞本身存在TLR3的表達，且激動劑預處理后，減輕原代皮質神經元在缺氧環境下的損傷，但造成此現象的縱向、橫向通路聯系及機制并不十分清楚，因而，TLR3及MyD88非依賴通路的激活對腦缺血再灌注損傷的作用機制仍有待于進一步研究。

［1］Stoll G.Inflammatory cytokines in the nervous system：multifunctional mediators in autoimmunity and cerebral ischemia［J］.Rev Neurol（Paris），2002，158（10Pt 1）：887－891.

［2］Aderem A，Ulevitch RJ.Toll－like receptors in the induction of the innate immune response［J］.Nature，2000，406（6797）：782－787.

［3］Hua F，Ma J，Ha T，et al.Activation of Toll－like receptor 4 signaling contributes to hippocampal neuronal death following global cerebral ischemia／reperfusion［J］.J Neuroimmunol，2007，190（1／2）：101－111.

［4］Hua F，Ma J，Ha TZ，et al.Differential Roles of TLR2and TLR4in acute focal cerebral ischemia／reperfusion injury in mice［J］.Brain Res，2009，1262：100－108.

［5］Préhaud C，Mégret F，Lafage M，et al.Virus infection switches TLR－3－positive human neurons to become strong producers of beta interferon［J］.J Virol，2005，79（20）：12 893－12 904.

［6］Dirnagl U，Iadecola C，Moskowitz MA.Pathobiology of ischaemic stroke：an integrated view［J］.Trends Neurosci，1999，22：391－397.

［7］Loh KP，Huang SH，De Silva R，et al.Oxidative stress：apoptosis in neuronal injury［J］.Curr Alzheimer Res，2006，3：327－337.

［8］Kilic E，Kilic U，Matter CM，et al.Aggravation of focal cerebral ischemia by tissue plasminogen activator is reversed by 3－hydroxy－3－methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor but does not depend on endothelial NO synthase［J］.Stroke，2005，36（2）：332－336.

［9］David Brea Tomás，Sobrino Pedro，Ramos－Cabrer.Inflammatory and neuroimmunomodulatory changes in acute cerebral ischemia［J］.Cerebrovasc Dis，2009，27（suppl 1）：48－64.

［10］Mabuchi T，Kitagawa K，Ohtsuki T，et al.Contribution of microglia／macrophages to expansion of infarction and response of oligodendrocytes after focal cerebral ischemia in rats［J］.Stroke，2000，31（7）：1 735－1 743.

［11］Zhu Y，Yang GY，Hlemeyer B，et al.Transforming growth factor－beta 1increases bad phosphorylation and protects neurons against damage［J］.J Neurosci，2002，22：3 898－3 909.

［12］Marshak－Rothstein A.Toll－like rece ptors in systemic autoimmune disease［J］.Nat Rev Immunol，2006，6（11）：823－835.

［13］Aderem A，Ulevitch RJ.Toll－like receptors in the induction of the innate immune response［J］.Nature，2000，406（6797）：782－787.

［14］Katherine AF，Sarah MM，Kerrie LF，et al.IKK epsilon and TBK1are essential components of the IRF－3signaling pathway［J］.Nat Immunol，2003，4（5）：491－496.

［15］Kariko K，Ni H，Capodici J，et al.mRNA is an endogenous ligand for Toll－like receptor 3［J］.J Biol Chem，2004，279：12 542－12 550.

［16］Kim BS，Lim SW，Li C，et al.Ischemia－reperfusion injury activates innate immunity in rat kidneys［J］.Transplantation，2005，79：1 370－1 377.

［17］Ha T，Hua F，Li Y，et al.Blockade of MyD88attenuates cardiac hypertrophy and decreases cardiac myocyte apoptosis in pressure overload induced cardiac hypertrophy in vivo［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006，290：H985－H994.

［18］Zhai Y，Shen X，O＇Connell R，et al.Edge：TLR4activation mediates liver ischemia／reperfusion inflammatory response via IFN regulatory factor 3－dependent MyD88－independent pathway［J］.J Immunol，2004，173：7 115－7 119.

［19］Kim BS，Lim SW，Li C，et al.Ischemia－reperfusion injury activates innate immunity in rat kidneys［J］.Transplantation，2005，79：1 370－1 377.

［20］Sharma S，Tenoexer BR，Grandvaux N，et al.Triggering the interferon antiviral response through an ikk－related pathway［J］.Science，2003，30（12）：1 148－1 151.

［21］Farina C，Aloisi F，Meinl E.Astrocytes are active plays in cerebral innate immunity ［J］.Trends Immunol，2007，28（3）：138 214.

［22］Ziegler G，Harhausen D，Schepers C，et al.Tlr2has a detrimental role in mouse transient focal cerebral ischemia［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，359：574－579.

［23］Hua F，Ma J，Ha TZ，et al.Preconditioning with a TLR2 specific ligand increases resistance to cerebral ischemia／reperfusion injury［J］.J Neuroimmunol，2008，199（1／2）：75－82.