不同游離方式辣椒小孢子的胚胎發生

成 妍 ，巫東堂，馬蓉麗，魏學紅,焦彥生 ，吳海濤

（1.山西大學生命科學學院，山西太原030006；2.山西省農業科學院蔬菜研究所，山西太原030032；3.山西大學化工學院，山西太原030006）

辣椒（Capsicum annuum L.）原產于中美洲和美洲的熱帶地區，在世界各地普遍種植，是人們廣為熟知的一種蔬菜和調料品，營養價值極高[1]。辣椒種質資源變異豐富，根據其果實形態的不同，可以劃分為甜椒、牛角椒、羊角椒、線椒和朝天椒等類型。由于辣椒是常異花授粉植物，雜種優勢十分明顯。因此，進行辣椒單倍體培養技術的研究，對于選育具有突出優點的親本品系、加速育種進程、培育強優勢辣椒組合具有非常重要的意義[2]。

目前，花藥培養已經成為獲取辣椒單倍體較成熟的技術，已被應用于辣椒的遺傳育種工作中[3-5]。游離小孢子培養與花藥培養相比，具有不可比擬的優勢，不僅能避免愈傷組織和體細胞胚的產生，而且單倍體再生率較高[6]。同時，小孢子的單倍性和單細胞特性可以為遺傳轉化提供好的機會[7]。然而，目前有關辣椒游離小孢子培養的成功報道較少，遠遠沒有達到建立起完善的、高頻的小孢子培養再生體系的程度，還不能應用于遺傳育種或基礎性研究[8]，因此，非常有必要對辣椒游離小孢子培養技術進行深入細致的探索研究。

在前人研究的基礎上，本試驗以甜椒、牛角椒、羊角椒、線椒和朝天椒5個不同類型的10個辣椒品種為試材，研究直接機械游離、看護培養自然游離和先花藥預培養再機械游離3種不同的小孢子游離方式下辣椒小孢子的胚胎發生情況，旨在為推動辣椒游離小孢子培養的實用化研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗共采用10個辣椒品種（表1）。2010年12月下旬播種于山西省農業科學院蔬菜研究所辣椒課題組北營菜地，2011年2月下旬定植于試驗地溫室內，開花期間及時整理花枝，常規水肥管理，并注意控制病蟲害的發生。

表1 供試10個辣椒品種及其類型和來源

1.2 方法

于盛花期開始，每天 7：00—8：00 或 17：00以后從各品種健壯植株上摘取花藥尖端呈微紫色的花蕾（此時花蕾的小孢子大多處于單核靠邊期）[9-10]放入自封袋中，裝入冰盒帶回實驗室，置于4℃冰箱中預處理2 d。每次取3～5株的花蕾混合，以消除可能的單株間差異。

在超凈工作臺上，將花蕾放在70%的酒精中浸泡30 s后，用無菌水沖洗1次，再用0.1%升汞消毒8 min，然后用無菌水沖洗4次，每次5 min。用無菌濾紙吸干花蕾表面水分后，進行3種游離方式處理。

1.2.1 直接機械游離 在Y培養基（即蔗糖饑餓培養基，含有0.37 mol/L麥芽糖，10 mmol/LCaCl2，1 mmol/LMgSO4·7H2O，1 mmol/LKNO3，200 μmol/L KH2PO4，1 μmol/LKI，100 nmol/LCuSO4·5H2O，pH值為5.8）[11]中，采用擠壓法使小孢子游離出來，并且依次經75，38 μm的細胞篩過濾。濾液經400 r/min離心4 min，棄上清液，再用Y培養基懸浮小孢子并離心，重復3次至上清液無色透明，棄上清液，沉淀即為純化的小孢子。最后用Y培養基懸浮小孢子，并用血球計數板計數，調整小孢子密度約為1.0×105個/mL。每個培養皿（60 mm×15 mm）中分裝2 mL小孢子懸浮液，接種后用Parafilm膜封口。32℃下暗培養2 d后，回收小孢子，并用NLN液體培養基（含9%蔗糖）清洗，然后更換為NLN培養基，在25℃下懸浮暗培養。

1.2.2 看護培養自然游離 在無菌濾紙上，用消毒后的鑷子和解剖刀從花蕾中剝出花藥（除凈花絲），接種于固液雙層培養基（下層固體培養基為：NLN＋2%麥芽糖＋1%活性炭＋0.6%瓊脂，pH值為5.8；上層液體培養基為：NLN＋2%麥芽糖＋2.5 μmol/LZT＋5 μmol/LIAA，pH 值為 5.8）[12]中，每瓶接種20～24個花藥，將接種了花藥的培養瓶放入35℃的恒溫培養箱中黑暗預培養7 d，后轉入25℃下進行暗培養。

1.2.3 先花藥預培養再機械游離 同1.2.2方法，將花藥接種于盛有固體培養基（KM＋1 mg/L NAA＋2 mg/L KT＋1 mg/L BA＋0.6%瓊脂+10%葡萄糖，pH值為5.8）的培養瓶中。每瓶接種20～24個花藥。在33℃下暗培養7 d后，選取無污染無褐化且膨大的花藥進行機械游離。小孢子的游離、純化和密度調整方法同1.2.1，游離的小孢子僅經過75 μm細胞篩過濾。所用洗液為：MS＋3%蔗糖，pH值5.8；培養基為：KM＋1 mg/L NAA＋2 mg/L KT＋1 mg/L BA＋10%葡萄糖，pH值為5.8。將分裝好小孢子懸浮液的培養皿置于25℃下進行暗培養。

3種游離方式處理的液體培養基均采用過濾滅菌（依次通過0.45，0.22 μm的微孔濾膜），固體培養基均采用高壓滅菌。各處理每品種接種5個培養瓶或皿，重復3次。

1.2.2和1.2.3方法接種7 d后統計褐化率（發生褐化的花藥占接種花藥總數的百分率）；接種35 d后統計和分析各處理胚狀體產量（平均每瓶或皿獲得的胚狀體個數，包括球形胚、心形胚和子葉形胚等各時期的胚狀體）和子葉形胚狀體產量（平均每瓶或皿獲得的子葉形胚胚狀體個數）。

1.3 數據分析

采用Microsoft Excel軟件處理數據，用DPS軟件進行顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 直接機械游離小孢子的胚胎發生情況

直接機械游離小孢子接種后20 d，肉眼可見大小不均的球形胚出現，呈乳白色。供試的10份材料中，僅3號產生了大小不均的球形胚（表2），但獲得的球形胚不能進一步發育形成子葉形胚，因此，再生植株比較困難。其余材料中有部分基因型的游離小孢子或出現膨大，或已啟動分裂，但最終未能繼續分裂形成胚狀體。

表2 直接機械游離小孢子的胚胎發生情況

2.2 看護培養自然游離小孢子的胚胎發生情況

看護培養的花藥接種后漂浮在上層液體培養基表面。培養1 d后，花藥沉到下層固體培養基上。培養7 d后，部分花藥發生褐化死亡。培養2～3周時，未褐化的花藥正常開裂，釋放出小孢子進入培養基。培養4周后，可以看到球形胚和心形胚。培養5周后，球形胚和心形胚發育到魚雷形和子葉形胚。大多數胚狀體來自釋放的小孢子而不是來自黏附于花藥壁的小孢子。

在10份試驗材料中，分別從2，3，5號中獲得了胚狀體（表3）。其中，產量最高的是3號，為每瓶2.2個，最低的是2號，為每瓶0.4個。僅3，5號獲得子葉形胚，2號獲得的球形胚很難再生植株。各材料之間褐化率存在明顯差異，7號褐化率高達79.9%，胚胎發生較好的3號褐化率最低，為36.5%。誘導胚胎發生的3份材料的褐化率均低于50%，說明在看護培養中花藥褐化嚴重影響小孢子的胚胎發生。

表3 看護培養自然游離小孢子的胚胎發生情況

2.3 先花藥預培養再機械游離小孢子的胚胎發生情況

花藥在高溫預培養過程中，部分發生褐化變黑。經過7 d的預培養后，反應的花藥體積膨大，大小增大到原來體積的1.5倍左右。通過選取無污染無褐化且膨大的花藥進行機械游離小孢子，聚集了已啟動雄核發育的小孢子，因此，胚胎發生效果好于前2種游離方式（表4）。不僅在看護培養中有胚狀體產生的2，3，5號材料有子葉形胚產生，而且在看護培養中沒有胚胎發生的4，8號材料也獲得了胚狀體，其中，8號材料還有子葉形胚形成。但是，各材料花藥預培養后的褐化率均高于看護培養，這可能是由于看護培養中的花藥在淺層液體培養基中既能保持通氣，又能與培養基充分接觸，從而延緩了花藥褐化。

表4 先花藥預培養再機械游離小孢子的胚胎發生情況

3 結論與討論

通過直接機械游離小孢子的方式誘導胚胎發生，在十字花科蕓薹屬和禾本科作物上都取得了較大成功[13]。本試驗中，供試的10份不同基因型材料通過直接機械游離小孢子的方式僅有1份啟動雄核發育，獲得了球形胚，但這些球形胚從此停止發育，不能進一步形成再生能力較強的子葉形胚。辣椒小孢子直接機械游離后很難存活[14]，可見，不同作物種類對小孢子游離方式的適應能力有明顯差異。

然而，Kim等[11]采用相同的小孢子分離方法，每皿胚產量高達54個，平均子葉形胚產量可達5.5個。培養效果差異如此之大，從一個角度證明了基因型的重要影響；另一方面可能是由于其采用Percoll密度梯度離心聚集了已啟動雄核發育的小孢子?？梢?，分離過程中的每一個細節都會影響辣椒小孢子的胚胎發生能力，有關直接機械游離進行小孢子培養的技術還需進一步探索研究。

本試驗通過看護培養自然游離小孢子和先花藥預培養再機械游離小孢子的胚胎發生情況好于直接機械游離小孢子，說明辣椒小孢子最初的脫分化對花藥壁有依賴作用?；ㄋ幈诮M織在小孢子培養前期作用十分重要，不但能保持適當的滲透壓，還能從培養基中吸收營養，供小孢子進一步生長發育。

相比先花藥預培養再機械游離小孢子方式，看護培養自然釋放方式不會對小孢子造成損傷，但培養效果不佳。這可能是由于高溫預培養后，花藥壁組織處于衰老狀態，不僅不能從培養基中吸收營養，而且本身的營養物質也被耗盡，影響花粉胚狀體的形成和完全發育。通過機械游離使花藥壁及時破裂，有利于多核花粉和球形胚吸收營養并繼續發育。就花藥預培養過程中的褐化問題，可參考辣椒花藥培養研究，在培養基中添加一定量的AgNO3或Vc，抑制乙烯產生，從而降低花藥的褐化率[15-16]。

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