MDCK細胞庫的建立及其生物學特性研究

王家敏 ，平 玲 ，沈武玲 ，徐水林 ，魏園園 ，馬忠仁 ，喬自林

（1.甘肅省動物細胞工程技術研究中心，甘肅蘭州730030；2.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730030；3.蘭州民海生物工程有限公司，甘肅蘭州730010）

MDCK細胞系（Madin-Darby canine kidney cells）是從犬腎組織中分離培養獲得的上皮樣貼壁細胞，該細胞系可連續傳代[1]。MDCK細胞系可以用于多種病毒的繁殖和純化，如禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）、呼腸孤病毒（Reovius）、腺病毒（Adenovirus）、犬細小病毒（Canine parvovirus，CPV）、貓粒細胞缺乏癥病毒（Feline panleukopenia virus，FPLV）等。近年來，大量研究表明，MDCK細胞系可以替代雞胚用于流感及禽流感病毒的監測、研究及其疫苗生產[2-5]。

本研究從ATCC，CCTCC，北京協和細胞資源中心及某企業引進4株MDCK細胞系，建立相應的細胞庫，并對引進細胞系的基本生物學特性進行了研究，旨在為開展MDCK細胞及流感細胞基質疫苗的研究提供基礎理論依據和細胞資源。

1 材料和方法

1.1 材料

供試儀器：CKX41型熒光倒置相差顯微鏡（Olympus），CX21型普通顯微鏡（Olympus），液氮罐，超凈工作臺，CKX40-32PH型倒置相差顯微鏡（Olympus），3110 型 CO2培養箱（Thermo）。

試驗材料：胎牛血清（蘭州民海），DMEM（Gibco），胰蛋白酶（Gibco），DMSO（Thermofisher），TSB（DIFCO），THIO（DIFCO），秋水仙素（Sirius進口分裝），脂質體（LipofectamineTM2000，invitrogen），紅色熒光蛋白質粒（pDsRedMonomer-N1，Clontech），Hoechst33258（Sigma）等。

1.2 方法

1.2.1 細胞引進及細胞庫的建立 分別從ATCC（購買）、CCTCC（購買）、北京協和細胞資源中心（購買）及某企業（贈送）引進4株MDCK細胞系，擴增培養后凍存，分別建立種子細胞庫和工作細胞庫。

1.2.2 生物學特性研究

1.2.2.1 復蘇細胞 從液氮罐中取出凍存管，按照常規方法復蘇細胞，2 h后換加等量的新鮮完全培養基，降低DMSO對細胞的損傷[6]。

1.2.2.2 活力檢測 完成細胞復蘇后，取少量細胞懸液，運用臺盼藍染色法進行細胞活力測定[7]。

1.2.2.3 形態觀察 培養過程中用生物倒置顯微鏡觀察細胞的生長形態，并拍照。

1.2.2.4 生長曲線 將復蘇后傳代1次的細胞，調整細胞密度為1.0×104個/mL，按每孔1 mL接種到24孔培養板上，置于37℃的CO2培養箱中培養，每隔24 h消化3孔計數細胞量，直至細胞密度降低為止，繪制生長曲線并求得最大增殖密度和倍增時間（PDT）[8]。

1.2.2.5 微生物污染檢測

1.2.2.5.1 細菌、真菌檢測 傳代細胞均用無抗生素的培養基。在培養過程中肉眼觀察培養基是否出現渾濁現象，并在顯微鏡下觀察有無活動的黑色顆粒；從培養瓶中取2 mL細胞培養基分別加入THIO和TSB培養基中，培養14d觀察結果。

1.2.2.5.2 病毒檢測 利用直接觀察法、細胞培養法及紅細胞吸附法檢測4個來源的細胞[9]。

1.2.2.5.3 支原體檢測 運用培養法及DNA熒光染色法[9]對4個來源的細胞進行檢測。

1.2.2.6 染色體分析 按常規方法進行染色體制片，Gimesa染色后油鏡下觀察并拍照，對50個鋪展完好的中期相的染色體數目進行統計[10]。

1.2.2.7 熒光蛋白質粒轉染表達 采用紅色熒光蛋白質粒進行轉染表達[11]。

2 結果與分析

2.1 MDCK細胞系形態學觀察

分別復蘇4株MDCK細胞系，培養至48 h，顯微觀察發現，細胞形態較為規則，均呈扁平狀，貼壁后呈三角形及不規則的多角形，中央有扁圓形細胞核，細胞之間相互銜接或呈鑲嵌狀緊密排列，細胞增殖較快，生長旺盛。復蘇后細胞生長狀態良好（圖 1～4）。

2.2 MDCK細胞系復蘇細胞活率

MDCK（ATCC）細胞系復蘇細胞活率最少達到 91.5%，平均為 95.2%；MDCK（CCTCC）細胞系復蘇細胞活率最少達到92.8%，平均為96.6%；MDCK（協和）細胞系復蘇細胞活率最少達到93.7%，平均為95.1%；MDCK（某企業）細胞系復蘇細胞活率最少達到91.3%，平均為97.2%。

2.3 復蘇MDCK細胞系生長曲線

4株MDCK細胞系生長曲線均呈S型（圖5），其中，MDCK（ATCC）細胞系最大增殖密度6.62×105個 /mL，平均倍增時間 23.51h；MDCK（CCTCC）細胞系最大增殖密度為6.58×105個/mL，平均倍增時間為24.12 h；MDCK（協和）細胞系最大增殖密度為6.29×105個/mL，平均倍增時間為24.73 h；MDCK（某企業）細胞系最大增殖密度為6.86×105個 /mL，平均倍增時間為 23.48 h（表 1）。

表1 MDCK細胞系不同時間下細胞密度（×104個/mL）

2.4 微生物污染檢測

2.4.1 細菌、真菌檢測 4株細胞系在培養過程中均未發現培養液渾濁及活動的黑色顆粒；THIO和TSB培養基檢測均為陰性，并且陰性、陽性對照成立。

2.4.2 病毒檢測 在培養過程中，利用倒置相差顯微鏡觀察未見病毒引起的細胞病變現象；將4株細胞系分別接種至猴源細胞、人源二倍體細胞和同種不同批次的細胞，亦未見病毒引起的細胞損傷及病變現象；紅細胞吸附試驗為陰性。

2.4.3 支原體檢測

2.4.3.1 培養法 細胞培養液分別接入支原體瓊脂培養基中培養14 d，4株細胞系均沒有出現任何菌落。

2.4.3.2 DNA熒光染色法 待檢細胞用熒光染料（Hoechst33258）染色后，只有細胞核出現藍色熒光，細胞核與細胞表面之間看不到熒光（圖6）。

2.5 MDCK細胞核型分析結果

分別對4株MDCK細胞系的50個鋪展完好的中期相的染色體數目進行統計，結果顯示，4株MDCK細胞系的染色體均為2n＝78，染色體中期分裂相如圖7～10。

2.6 熒光蛋白質粒轉染表達

4株MDCK細胞系經脂質體介導紅色熒光蛋白質粒（pDsRed-Monomer-N1）轉染后，12 h均可見發紅色熒光的細胞，分布均勻，但強度較弱。轉染24 h后陽性細胞明顯增多，強度增強（圖11），表明4株MDCK細胞系均能有效地轉染外源基因。

3 討論

最初的MDCK細胞系在1958年由Madin等[12]從美國的1頭Cocker Spaniel母曲架犬的腎臟組織分離培育而建立，該細胞系在方瓶中培養時會集合成緊密連接蛋白并分泌到表面球狀頂部，形成單細胞層。

傳統的流感疫苗都是采用雞胚生產的，此種方法受到很多因素的限制，如可靠雞胚的來源、較長的培養周期、繁瑣的操作步驟以及很容易受污染等[13-14]。MDCK由于其具有培養容易、增殖快、流感病毒感染效率高等特點，被作為流感病毒疫苗生產的重要細胞系之一。

本研究從ATCC，CCTCC，北京協和細胞資源中心及某企業分別引進4株MDCK細胞系，傳代擴增后建立相應的細胞庫，其中，種子細胞庫各30支，工作細胞庫40支。復蘇細胞培養到第3天進入指數生長期，第5天進入平穩生長期，倍增時間在23.48～24.73 h之間，最大增殖密度在6.29×105～6.86×105個/mL，表明此4株細胞系均生長比較快，且細胞體積較小。外源質粒（pDsRed-Monomer-N1）均能在4株MDCK細胞系內進行有效復制、轉錄、翻譯和翻譯后修飾，能用于瞬時轉染及永久表達系的建立，這為以后對MDCK的結構基因組、功能基因組以及轉基因研究等工作提供了依據。通過本項研究已成功建立MDCK細胞庫，為流感細胞基質疫苗的研究及開發提供了基礎理論依據和細胞資源。

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